Annexe 1 

: Préparation des échantillons, de la solution mère et des

dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique selon ISO
6887-1

Début de la préparation de la SM

Temps ≤ 30min
Le temps ne doit pas dépasser 45 min

Fin de la préparation de la SM

Début de la préparation des dilutions décimales

Le moment où l’inoculum entre en contact avec le milieu

de culture

Ensemencement dans la masse Ensemencement en surface

Le temps de la solidification de la Déposer l’inoculum au centre de la boite

gélose ne doit pas dépasser 10min. identifiée. Etaler de façon uniforme et le
(ISO 7218) plus rapidement possible à la surface du
milieu, avec un étaleur jetable ; jusqu’à
ce qu’il ne reste plus de liquide visible à
la surface (ISO 7218) 15 min

Retourner sans tarder les boites ensemencées et les placer rapidement à l’étuve
réglée à la température appropriée 1
 Annexe 2 : Méthode de routine pour le dénombrement des
microorganismes
(FMAT : Flore Mésophiles aérobies totale)
Méthode par comptage des colonies obtenues à 30 °C selon ISO 4833

Préparation de la
solution mère Peser 10g d’échantillon +90 g d’EPT

1 ml de la SM + 9 ml du diluant Tryptone sel

Préparation des
dilutions On procède de la même façon pour les autres dilutions

Isolement Transférer 1ml de la SM et /ou 1ml des dilutions décimales

dans chaque boite de pétri

1er Coulage Couler dans chaque boite 15 ml de PCA

2ème Coulage Couler une deuxième couche d’environ 4mL de la GB

Incubation Laisser se solidifier puis incuber les boites 72 h à

30°C ± 1°C

Résultat Comptage des colonies

Le résultat est exprimé en UFC/g d’échantillon

NB :
*Tenir compte de toutes les colonies
*Tenir compte des boites contenant entre 30 et 300 colonies

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 Annexe 3 : Méthode de routine pour le dénombrement des
Coliformes Thermotolérants par comptage des colonies à 44 °C Selon
ISO 4832

Préparation de la Peser 10g d’échantillon +90ml d’EPT

solution mère

Préparation des 1ml de la SM + 9ml du diluant Tryptone sel

dilutions on procède de la même façon pour les autres dilutions

Isolement Transférer 1ml de la SM et /ou 1ml des dilutions décimales

dans une boite de pétri

1er Coulage Couler dans chaque boite 15ml de VRBL

2ème coulage Laisser se solidifier et ajouter environ 4ml de VRBL

Incubation Après solidification, Incuber les boites 24h à 44°C

Résultat Comptage des colonies

Le résultat est exprimé en UFC/g d’échantillon

N.B : *Les colonies caractéristiques sont violacées d’un diamètre supérieur ou

égal à 0.5 mm et parfois entourées d’une zone rougeâtre. Il faut tenir compte des
boites contenant au moins 150 colonies.

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 Annexe 4 : Méthode de routine pour le dénombrement des
Staphylocoques à coagulase + par comptage des colonies à 37°C selon
la méthode horizontale ISO 6888-1

Préparation de la Peser 25g d’échantillon +225ml d’EPT

solution mère

Préparation des 1ml de la SM + 9ml du diluant Tryptone sel dilution de 10-1

dilutions on procède de la même façon pour les autres dilutions

Isolement
Transférer 0,1ml de la SM et /ou 0,1ml des dilutions décimales
à la surface d’une boite de pétri contenant le milieu BP

Etaler à l’aide d’un étaleur stérile

sans toucher les bords de la boite

Incubation Incubation à 37°C ±1°C

Confirmation
3 colonies caractéristiques et 3 non caractéristiques
Sont mises dans des tubes contenant 5 ml de BCC
Et sont incubés à 37°C ±1°C pendant 24h ±2h

On prélève 0.3 ml du BCC auquel on ajoute 0.3 ml du plasma de lapin

on incube à 37°C ±1°C pendant 24h ±2h

Résultat Les tubes présentant une coagulation sont considérés positifs

Le résultat est exprimé en UFC/g

N.B :
*Colonies caractéristiques : Noires ou grises brillantes et convexes de 1,5 à 2,5
mm entourées d’une zone d’éclaircissement.
*Colonies non caractéristiques : Grises dépourvues de zones claires noires et
brillantes avec ou sans bord blanc étroit et une zone claire ou petite

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 Annexe 5 :Méthode de dénombrement en anaérobiose des
bactéries sulfito-réductrices par comptage des colonies selon iso
15213

Préparation de la
solution mère Peser 10g d’échantillon +90 ml d’EPT

Préparation des 1ml de la SM + 9ml du diluant Tryptone sel dilution de 10-1

dilutions on procède de la même façon pour les autres dilutions

Isolement Transférer 1ml de la SM et /ou 1ml des dilutions décimales

dans chaque boite de pétri

1er Coulage
Couler dans chaque boite 15ml de TSC+D-cyclosérine

2ème coulage Laisser se solidifier, puis adjonction

d’une couche de 10ml de TSC+D-cyclosérine

Incubation Laisser se solidifier puis incuber en anaérobiose

dans des jarres d’anaérobiose à 37°C durant 20h ±2h

Résultat Comptage des colonies noires

Le résultat est exprimé en UFC/g d’échantillon

NB :
*Compter les colonies noires et tenir compte des boites contenant moins de 150
colonies

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Annexe 6 : Mode opératoire de recherche des Salmonella spp
selon ISO 6579⁄2002 + Am1 rectificatif, technique 1⁄2004

Pour la préparation de la SM, utiliser l’EPT à température

ambiante.
Si la masse de la prise d’essai spécifiée n’est pas 25g, utiliser
enrichissement

la quantité nécessaire de milieu de pré-enrichissement pour

obtenir une dilution au 1⁄10.
Pré-

Incubation à 37°C±1°C pendant 18h±2h

Enrichissement

0,1mL de culture + 10mL de 1mL de culture + 10mL de

bouillon RVS. Incubation bouillon MKTTn
sélectif

pendant 24h±3h à 41,5°C±1°C Incubation pendant 24h±3h à

37°C±1°C

Milieu XLD et un second milieu gélosé au choix

Incubation pendant 24h±3h à 37°C±1°C
Isolement

Au moins une colonie caractéristique pour chaque milieu et

quatre colonies si la première est négative

Gélose nutritive, incubation pendant 24h±3h à 37°C±1°C

Confirmation

Confirmation biochimique Confirmation sérologique

Expression des résultats

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 Annexe 7 : Méthode de dénombrement des
entérobactéries à 30 °C
Méthode par comptage des colonies obtenues à 30 °C selon NM
08.0.109

Préparation de la
solution mère Peser 10g d’échantillon +90 g d’EPT

1 ml de la SM + 9 ml du diluant Tryptone sel

Préparation des
dilutions On procède de la même façon pour les autres dilutions

Isolement Transférer 1ml de la SM et /ou 1ml des dilutions décimales

dans chaque boite de pétri

1er Coulage Couler dans chaque boite 15 ml de VRBG

2ème Coulage Couler une deuxième couche d’environ 4mL de VRBG

Incubation Laisser se solidifier puis incuber les boites 24 h à

30°C ± 1°C

Résultat Comptage des colonies

Le résultat est exprimé en UFC/g d’échantillon

NB :
*Tenir compte de toutes les colonies roses ou rouges
*Tenir compte des boites contenant entre 30 et 300 colonies

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 Annexe 8 : Méthode de dénombrement des
microorganismes à 22°C et 36°C de l’eau
Méthode par comptage des colonies obtenues selon ISO 6222

Isolement Transférer 2ml de la SM et /ou 2ml des dilutions décimales

dans chaque boite de pétri

1er Coulage Couler dans chaque boite 15 ml de Gélose à l’extrait de

levure

Incubation à 22°C Incubation à 36°C

Incubation pendant 68 h pendant 44 h

Résultat Comptage des colonies

Le résultat est exprimé en UFC/g d’échantillon

NB :
*Tenir compte de toutes les colonies
*Tenir compte des boites contenant entre 30 et 300 colonies

8
 Annexe 9 : Méthode de dénombrement des
entérobactéries intestinaux de l’eau
Méthode par comptage des colonies obtenues selon ISO 7899-2

Isolement Mise en place de la membrane sur milieu selectif (Slanetz)

Incubation
Incuber à 37°C pendant 48h
Si les colonies apparaissent rouges ou roses

Confirmation Transfert de la membrane sur une gélose à la bile à l’esculine

et à l’azoture et incubée à 44°C ±1°C pendant 2h

Résultat Comptage des colonies noires

Le résultat est exprimé en UFC/g d’échantillon