TRAVAUX PRATIQUES

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
 REALISE PAR : Amine Sadouk grp3

TP 1: Recherche des principaux germes

pathogènes/indicateur dans le fromage bleu

Objectif du TP:

Ce TP est a pour objectif de faire une recherche de quelques germes pathogènes

dans un aliment, et pour bien préciser, on cherche des bactéries pathogènes, FMAT, CF,
CT, E. coli, BAL, LM et Staphylococcus , dans le fromage bleu.

Matériel :

Bec Bunsen - Balance - Sacher - les boites de Pétri - stomacher -

Tubes à essaies - Pipette jaugée - L’étuve microbiologique - Un bécher -
spatule .

Réalisation des travaux :

Préparation d’échantillon
 La mesure du poids : à l’aide d’une spatule et une balance on prend
environ de 25g de fromage bleu.

 Préparation de solution mère : dans notre cas on a le fromage à l’état

solide pour préparer une solution mère (10-1) à partir de 25g de fromage
en prend cette quantité de fromage avec 225ml 0,9 mol/100ml de NaCl
(diluant) mélangé dans un Sacher à l’aide de l’homogénéisateur Stomacher
durant 3 minutes.

 Préparation des solutions fille : après la préparation de notre solution

mère et dans une zone stérile (la hotte) essayée de prend avec une pépite
 jaugée 1ml de solution mère videz-le dans un tube rempli avec 9ml d’eau
diluant

Préparation des boites de Petrie :

Après la préparation de notre échantillon en doit préparer les boit de Petrie (la
nomenclature) pour l’incuber dans l’étuve à cause de les différents germes
ciblées je préfère d’utiliser un tableau pour la simplification de la documentation.

Germe Milieu de T°C Ensemencement Dilutions Durée culture

d’incubation ciblés d’incubation
FMAT PCA 30°C En masse 10-3-10-7 72h
CF VRBL 44.5°C En masse 10-1-10-5 24h
CT VRBL 30°C En masse 10-1-10-5 24h
E. coli Mac Conkey 44.5°C En surface 10-1-10-5 24h
BAL MRS 30°C En surface 10-3-10-7 72h
LM PDA Ambiant En surface 10-3-10-7 5jrs
Staphylocoque BP 30°C En surface 10-1-10-5 24h

Ensemencement en masse : Prélever un volume précis de 1 ml à

l’aide de la pipette graduée stérile, puis déposer ce volume goutte par goutte sur
une boîte de Pétri vide et couler 10 ml de milieu gélosé maintenu en surfusion
Homogénéiser en gardant à la boîte de Pétri fermée des mouvements circulaires.

Ensemencement en surface : Prélever un volume précis de 0,1 ml à

l’aide de la pipette graduée de 1 ml stérile, puis déposer ce volume au centre de
la gélose solide, Étaler à l’aide d’une pipette râteau.

Résultats :
 Transférer 10 ml de filtrat dans l’éprouvette et ajuster le volume jusqu’à 40 ml
d’Ethanol à 90°C ;

Germe 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

FMAT ----------- ----------- nc 106 35 4 1
- -
CF Nc Nc 282 36 0 ----------- -----------
- -
CT Nc nc 181 155 ----------- ----------- -----------
- - -
E.coli 105 1 0 0 0 ----------- -----------
- -
BAL ----------- ----------- nc 115 22 7 0
- -
LM ----------- ----------- nc 186 57 20 3
- -
Staphylocoque Nc 205 112 14 2 ----------- -----------
- -

Nombre UFC/ml :
𝐶
N= ×
𝑣 𝑑

: La somme de colonies comptées.

𝑣 : volume de l’échantillon déposé.

𝜂1𝑒𝑡 𝜂2 : nombre des bactéries comptés dans la (+) faible et le (+) forte dilution.

𝑑 : le facteur de dilution de la (+) forte dilution au j’ai commencé le comptage.

Conclusion :
On a étudié dans ce TP la méthode de préparation un échantillon solide pour
l’analyser recherchons de défirent germes qui peut détruire au port un risque
sanitaire a le consommateur.
 TP2 : Dénombrement des principaux germes dans
l’eau de puit (méthode NPP)

Objectif du TP:

L’objectif général de ce TP est de nous montrer l’attitude de rechercher les coliformes

totaux et les streptocoques totaux par la méthode de nombre le plus probable (NPP).

Matériel :

Bec Bunsen - Balance - Sacher - les boites de Pétri - stomacher -

Tubes à essaies - Pipette jaugée - L’étuve microbiologique - Un bécher -
spatule - Eau de puit - Milieux BCPL - milieu de Rothe - Bain marie - GVF - additifs (sulfate
de Na et Alun de fer)

Mode Opératoire :

Préparation de milieu de culture :

On prépare trois séries de tubes pour le milieu BLBVB et trois autres pour le
milieu Litscky, Chaque milieu contient une série deux fois concentrée et une série
une fois concentrée.
Pour chaque milieu on prépare six tubes, et chaque tube contient 10ml de
milieux de culture.

L’opération :

Après la phase de préparation, on prend, avec une pipette stérile, 10ml

de la solution mère (en n’a pas de dilution) on le met dans le premier tube
concentré deux fois, on reprend la même opération pour les trois tubes dilués ½
(de concentration double).
 On prend après, 1ml/0.1ml dans la solution mère et on le met dans le premier
tube de concentration simple, on répète la même opération pour les autres
tubes de concentration simple.

L’incubation :

Avant de finir notre TP on prend tous les tube avec leurs support pou posé
dans l’étuve sous une température de 30°C (ou 37°C) dans une durée limitée à
24h (ou 48h) pour une croissance idéale.

Indicateurs de présent pour BCPL :

▪ Le gaz
▪ Changement de couleur Indicateurs
de présent pour Roth :
▪ Le trouble
▪ Précipita violette

Pour ASR :
Ce sont des bactéries anaérobies, caractérisées par la présence des spores
plurirésistantes (naturellement plus résistants que les formes végétatives).
Résistance à la chaleur plus importante.
Dosage :
Après destruction des formes végétatives par chauffage à 65°C pendant 15 min,
l’échantillon à analyser (l’eau de puit) est incorporé dans un milieu de base de
couleur verte GVF (Gélose Viande Foie) additionnée de sulfite de Na et Alun de
fer.
Après solidification et incubation de 24h pour 1ère lecture, puis une 2ème
lecture au bout de 48 h. La présence de germes sulfitoréducteur est traduit par
un halo noir du sulfure de fer autour des colonies.
 Conclusion :
Il y a de nombreux facteurs visibles à l’œil nu qui nous montrent la présence ou pas
des germes dans l’eau à l’aide de la méthode NPP.

TP 3 (suite TP2) : Dénombrement des principaux germes

dans l’eau (méthode NPP)
Ce TP est la deuxième partie de TP précèdent, on s’intéresse aux résultats
obtenus Dans le TP précèdent. On peut l’est introduire comme suit :

Milieu Roth :

VOLUME 10ML 1ML 0.1ML

ASPECT DES Double Simple Simple
TUBES concentration concentration concentration
RESULTATS - - - - - -
NOMBRE DE (+) 0 0

REGROUPEMENT 0 0

Milieu BCPL :

VOLUME 10ML 1ML 0.1ML

ASPECT DES Double Simple Simple
TUBES concentration concentration concentration
RESULTATS + + + + + + + - - NOMBRE DE (+)
3 3 1
REGROUPEMENT 331 ------------------------ ------------------------
-- ---

Objectif du TP :

L’objectif de ce TP est de continue la méthode NPP (Etape confirmative)

Mode opératoire :
 Pour les coliformes totaux :
Recherche et dénombrement des coliformes fécaux, essentiellement E. coli.
Parmi ces 14 coliformes totaux, on dénombre les coliformes fécaux.
Pour chaque Flacon (+) et Tube (+), on prend un milieu d’isolement = milieu Schubert =
milieu mannitol-indole (transparent).

Pour les streptocoques fécaux :

A partir de chaque tube et flacon positifs → ensemencement dans un milieu spécifique

= milieu EVA (Ethyle violet acide de Na) Incubation à 37°C pendant 24 h. Tous les tubes
et les flacons présentant une louche microbienne sont considérés comme positifs, on
note aussi généralement la présence au fond des tubes d’une pastille violette
(facultative).
Le dénombrement se fait comme précédemment sur table de Mac Gray. Mes dans
notre cas rien n’est changé, on reprend la même opération précédente en ajoutant
1ml dans 2 tubes de concentration double et simple, dans d’autres tubes contenant
10ml de milieu de culture.

Calcule de NPP :

NPP=NPN×FD×FM

FM : facteur de multiplication
FD : facteur de dilution =1/d
NPN : d’après la table de Mac Grady
• Dans notre cas pour Milieu BCPL :
FM=1
FD=1/10-1 =10
NPN : le regroupement de 331 dans table de Mac Grady signifie 46
Alors : NPP=46×10=460/100ml
NPP=4.6/ml

Conclusion :
On peut conclure en disant que le microbiologiste il faut qu’il ait l’habilité de détecter la
croissance microbienne dans des milieux de cultures diverses, et de même savoir les
différents facteurs qui montre cette croissance pour chaque microorganisme

TP4 : analyses d’eau par filtration :

Principe :
Cette technique consiste à filtrer une quantité d’eau à travers une membrane d’ester de
cellulose, de marque Millipore ou Sartorius, de porosité définie 0,45 µm, le diamètre du
filtre est de 25 mm
Cette porosité est susceptible de retenir les particules.
Cette membrane est ensuite déposée sur milieu gélosé approprié qui va permettre aux
coliformes de se développer de manière préférentielle.

Méthode de travail :
Filtration sur membrane :
Près du bec bunsen, placer la membrane stérile sur le système de filtration. Mettre en
place la trompe à vide.
Agiter le flacon de prélèvement de l’eau à analyser vigoureusement. Verser le volume
approprié (10 ou 100 ml) de l’échantillon dans le système à filtration. Filtrer avec
trompe à vide.
Ensemencement
Près du bec, ouvrir le système de filtration. Retirer la membrane avec une pince stérile.
Déposer la membrane sur la gélose, face contaminée en haut. Les éléments nutritifs de
la gélose traversent la membrane ce qui permet ainsi le développement des bactéries
en surface.

Conclusion :
 On peut conclure en disant que le traitement des eaux a d’importance majeur
face aux microorganismes et pour garder la sécurité sanitaire.