TP MICROBIOLOGIE M56

BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

1- Objectif du T.P.
2- Définitions et remarques préliminaires
3- Les manipulations à réaliser : Divers ensemencements

3.1- Ensemencer un Bouillon Nutritif (BN) à partir d’une colonie sur GN.

3.2- Ensemencer un B.N. à partir d’une culture en Bouillon nutritif.

3.3- A partir du tube marqué “S” effectuer une dilution au 1/10e = 10-1 (a) puis
au 1/100e = 10-2 (b).

3.4- Réaliser un ensemencement dans la masse en boîte de Pétri à partir des

dilutions précédentes (2 boîtes par dilution).

3.5- Réaliser un ensemencement en surface : 0,1ml de chacune des dilutions,

sur GN coulée préalablement en boîte de pétri et bien solidifier (2 boîtes par
dilution).

3.6- Réaliser un isolement en boîte de Pétri par la méthode des quadrants à

partir d’une colonie sur milieu solide ou à partir d’un Bouillon.

3.7- Ensemencer une gélose en pente par stries transversales, à partir d’une
culture en milieu solide ou à partir d’une culture en milieu liquide.

4- Lectures - Résultats - Commentaires.

1
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

1- Objectif du T.P. :
Apprendre à manipuler en asepsie en réalisant divers procédés d’ensemencements

2- Définitions et remarques préliminaires

2.1- Définitions :
 Ensemencement : Opération qui consiste à porter des bactéries dans un milieu de culture.
 Repiquage : Transplantation d’une culture pure sur un milieu neuf.
 Isolement : Ensemencement effectué dans un but de séparation, de façon à obtenir, à partir des
bactéries présentes, des colonies distinctes. On isole une bactérie pour l’obtenir en culture pure (cf. p ).

2.2- Travail en Asepsie - Règles générales des ensemencements :

Ils doivent être pratiqués :

- dans des conditions d’asepsie parfaite : tout transfert doit se faire stérilement
- et être effectués sur des milieux favorables stériles.

Rappels :

1. Bien installer son poste de travail.

Cultures - Boites et tubes - Bouchons des tubes desserrés (vérifier).
2. Stériliser l’instrument d’ensemencement :

- Pipette Pasteur stérilisée (zone de Haute Température du bec).

- Si la pipette Pasteur doit être ouverte : stériliser - casser l’extrémité et stériliser à nouveau.
3. Puis laisser refroidir l’instrument en zone stérile.
4. Stériliser le col (ouverture) des tubes avant et après chaque transfert :
- Prendre, avec la main gauche (si on est droitier), le tube contenant la souche à ensemencer
(en milieu liquide ou solide)
- Homogénéiser au vortex ( cas d’un milieu liquide).
- Ouvrir le tube en zone stérile (bouchon dévisser avec le petit doigt de la main droite, celle-ci
restant presque immobile).
- Stériliser le col.
5. Effectuer le prélèvement avec l’instrument stérile et refroidi :
A l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée, on prélèvera une colonie (ou quelques colonies) - ou
un peu de culture s’il s’agit d’un milieu liquide.

6. Stériliser à nouveau le col puis refermer le tube

(la main gauche va chercher le bouchon maintenu dans la main droite ).
N.B. Maintenir constamment l’extrémité de la pipette dans la ZONE STERILE, SANS
TUER LES GERMES (attention à la chaleur).

7. Ensemencer le milieu "neuf" : Saisir le tube ou la boite de Pétri (suivre le même protocole
pour ouvrir et refermer le tube.
8. Stériliser les instruments ou les placer dans le bac à Javel (verre).

2
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

3. Identification précise des tubes et des boîtes : Indispensable

(Utiliser un feutre indélébile - écriture fine, ne masquant pas la culture)

 Nom
 Date (heure d’ensemencement parfois)
 Repérage du produit
 Nature du milieu utilisé
 Germes ensemencés ou flore recherchée

 Température et durée d’incubation

III. Manipulations

 Voir les schémas page 4 montrant quelques procédés

d’ensemencement.

 Réaliser les divers ensemencements décrits (pages 5 à 12) :

 soit à partir d’une culture sur gélose inclinée (G.N.)

 soit à partir d’une culture sur bouillon nutritif (B.N.)
 soit à partir d’une suspension "S".

3
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

N. B. POUR TOUTES LES MANIPULATIONS suivantes

Respecter LES INSTRUCTIONS SUR LE TRAVAIL ASEPTIQUE

1. Ensemencer un B.N. à partir d’une colonie sur Gélose nutritive.

A partir de la culture sur gélose inclinée ou sur boite de Pétri, mise à votre disposition :

- Prélever avec l’anse stérile ou une pipette Pasteur fermée stérile, une ou quelques colonies.

- L’inoculum est introduit dans le tube en évitant de toucher les parois puis on le met
au contact du liquide et on le frotte contre le verre pour obtenir une suspension
épaisse. Celle-ci est ensuite incorporée peu à peu à la totalité du liquide.

2. Ensemencer un Bouillon Nutritif à partir d’une culture en B.N.

A partir de la culture en Bouillon nutritif :

- Prélever un peu de culture à l’anse (stérile et refroidie) ou quelques gouttes avec une pipette Pasteur
stérile.

- Ensemencer un bouillon nutritif stérile :

o Introduire l’anse "chargée" dans le liquide
o Ou quelques gouttes (1 à 5) avec la pipette

4
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

3. Réaliser des dilutions au 1/10e à partir d’une suspension "S"

Technique souvent utilisée en microbiologie alimentaire pour le dénombrement des

bactéries (ou numération des bactéries).

A partir de la suspension (tube marqué “S”) :

Suspension 9 ml eau 9 ml eau

" S" (Eau physiologique stérile)

 Effectuer une dilution au 1/10e = 10-1 (tube a)

Attention. Il est important de bien identifier les tubes avec la dilution

concernée et de les classer sur le portoir dans le sens des dilutions.

 Homogénéiser la suspension à diluer (vortex)

 Introduire, seule la pointe d’une pipette (de 1ml) dans le liquide :

Attention :
Aspirer doucement (le liquide ne doit pas pénétrer dans le pipeteur) et refouler une fois.

Prélever alors 1ml et le transférer dans un tube (tube a) contenant 9 ml de diluant (eau
physiologique) et homogénéiser au vortex. On obtient une dilution au 1/10e soit 10-1

Placer la pipette utilisée de suite dans le bac à Javel.

Reprendre une pipette stérile de 1ml pour la 2e dilution
Attention : A chaque nouvelle dilution, changer systématiquement de pipette.

 Effectuer une dilution au 1/100e = 10-2 (tube b).


Homogénéiser le tube (a) 10 -1

Puis à partir de ce tube 10 -1 : Recommencer la même opération pour
obtenir le tube (b) dilué au 1/100e soit 10-2

5
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

4. Réaliser un ensemencement dans la masse, en milieu solide,

à partir des dilutions précédentes.
= Ensemencement en Profondeur

Placer un flacon de gélose nutritive stérile au bain-marie à 95°C – 100°C (45min).

Vérifier que la gélose soit bien fondue.

Mettre le flacon en attente au bain-marie à 47°C - 50°C (surfusion)

Préparer 2 boîtes par dilution.

Attention : Ne pas ouvrir les boites de Pétri hors de la zone stérile.


Pipeter stérilement 1ml de chaque dilution préparée lors de la manipulation n°3.

L’introduire dans les boites de Pétri : 1ml de (b) dans 2 boites, on a ainsi 2 boites à 10-2
et 1ml de (b) dans 2 boites, on a ainsi 2 boites à 10-1

Remarque : Changer de pipette à chaque dilution différente.

Cependant, pour économiser les pipettes,on peut commencer par la plus grande dilution et alors
n’utiliser qu’une seule pipette.

Couler la gélose maintenue en surfusion dans chacune des boites de Pétri (15ml environ).
Attention la gélose ne doit pas être coulée trop chaude : La température du flacon doit être
supportable pour votre main.

Homogénéiser par de légers mouvements de rotation à plat sur la paillasse : 3 fois à droite et 3 fois à
gauche par exemple.

Eloigner la boite de votre zone de travail et laisser solidifier sans remuer.

5. Réaliser un ensemencement en surface sur Milieu gélosé (G.N.)


Confectionner un étaleur ou pipette-râteau (cf. T.P.1)

Reprendre les dilutions (a) et (b) - cf. manipulation n°3 –

Homogénéiser le tube avant le prélèvement

Sur une gélose coulée préalablement dans une boite de Pétri et bien solidifiée, déposer 0,1 ml de
chacune des dilutions.

Etaler le liquide sur toute la surface, à l’aide d’un râteau (= étaleur), stérile et refroidi. Ne pas
toucher le bord de la boite.

Laisser le liquide s’absorber pendant 1/4 h.

6
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

6. Réaliser un isolement en boîte de Pétri

- Méthode des quadrants -

A réaliser à partir d’une colonie sur milieu solide ou à partir d’une culture en bouillon.

Tenue de la boite - Divers procédés :

Travail dans la zone stérile du "Microbio" (ou du Bec Bunsen)

Seul le fond est saisi

(1) (2) (3)

Couvercle
(boite retournée au départ)

Méthode des quadrants : 1. Inoculum porté par une

Pipette Pasteur boutonnée 2. Stries sur une moitié de la Boite
ou l’anse. puis stériliser l’instrument et le
laisser refroidir.
Départ

(a) Tracer les traits à la règle (b) Quadrants I et II

Quadrants: I II III IV
3. Puis rotation du poignet de 90°
et en partant du quadrant (II)
avec la pipette Pasteur stérilisée,
effectuer de nouvelles stries sur le
Quadrant ( III) ;
( L’instrument s’est "rechargé" sur
II ).
ensemencés
4. Stériliser la pipette et la refroidir
et en partant de (III) ensemencer
le dernier quadrant (IV) par stries.
Stériliser l’instrument.
7
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

7. Ensemencer une gélose en pente par stries transversales

A partir d’une culture en milieu solide ou à partir d’une culture en milieu liquide,
ensemencer un milieu gélosé en pente, avec un instrument plus ou moins "chargé".
Suivant le but de l’ensemencement on peut réaliser une culture massive ou un
isolement .
 L’inoculum est prélevé à la pipette bordée stérile ou à l’anse.
 Avec l’instrument " chargé", dessiner en remontant des stries sans érailler le
gélose.

Début des stries

Gélose en pente

Eau de condensation

 Stériliser l’instrument ou le déposer dans l’eau de Javel.

IV. Lectures après incubation et commentaires

8
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

APPLICATION

Binôme : ………………............ / Nom- Prénom : ……………………………

Vous travaillerez en binôme. Chaque étudiant du binôme réalisera la

manipulation. Le matériel de manipulation devra donc être récupérer en double.

En vous référant aux techniques présentées ci-dessus, répondre aux questions et

réaliser les manipulations demandées.

1- Citer tout le matériel nécessaire présent sur la paillasse lors des manipulations
en asepsie et préciser l’organisation du poste de travail.
- bec électrique
- bac à javel
- pissette alcool, javel, eau distillée

2- Rappeler les règles que doivent respecter les étudiants

avant de pénétrer dans le labo : tenue / cheveux/ bijoux / lav.age des mains
durant toute la manipulation : préparer la paillasse /éviter les déplacements /
lavage des mains / ne pas boire ne pas manger
en sortant du labo : remise en état paillasse + désinfection / lavage des mains

3.1.Ensemencer un Bouillon Nutritif (BN) à partir d’une colonie sur GN.

- Compléter le tableau relatif à la manipulation

Matériel Milieu
1 pipette pasteur¨K 1 boite de pétri + colonie
1 BN

- Quelles informations sont indiquées sur le tube

- BN, Initiales étudiant, dateN

- Effectuer la manipulation

9
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

3.2 Ensemencer un Bouillon Nutritif à partir d’une culture en B.N.

- Compléter le tableau relatif à la manipulation

Matériel Milieu
1 pipette pasteur déboutonnée ou anse 1 BN fourni
1 BN Stérile

- Effectuer la manipulation

3.3- A partir du BN de la manipulation précédente effectuer une dilution au

1/10e = 10-1 puis au 1/100e = 10-2

- Compléter le tableau relatif à la manipulation

Matériel Milieu
2 pipettes de 1 ml 1 BN
Propipette 2 tubes de 9 ml identifiés « initiales 10-1
Vortex et 10-2 »

- Préciser pourquoi il est nécessaire d’avoir autant de pipette de 1 ml que de

dilution à de réaliser et l’ordre dans lequel les dilutions sont réalisées.

L’objectif des dilutions est de pouvoir connaitre la quantité de MO ( bactéries)

dans une denrée alimentaire. Si l’on devait ensemencer la gélose à partir de la
solution mère les résultats seraient inexploitables car trop de colonies bactériennes
qui formeraient une seule masse. Les dilutions permettent de déconcentrer la
solution mère et de calculer après comptage des colonies sur les dilutions les plus
fortes la quantité de bactéries présentes.
Il est important de réaliser les dilutions dans le bon ordre et avec des pipettes
différentes afin de ne pas fausser les résultats et obtenir des colonies isolées.

- Effectuer la manipulation

10
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

3.4- Réaliser un ensemencement dans la masse en boîte de Pétri à partir des

dilutions précédentes (2 boîtes par dilution).

- Compléter le tableau relatif à la manipulation

Matériel Milieu
2 pipette de 1 ml 1 BN
Propipette 1 flacon de GN maintenu en surfusionà
Vortex 47°C
2 boites de pétri stériles à identifiés
« initiales + 10-1 et 10-2 »

- Effectuer la manipulation

3.5- Réaliser un ensemencement en surface : 0,1ml de chacune des dilutions,

sur GN coulée préalablement en boîte de pétri et bien solidifier (2 boîtes par
dilution).

- Compléter le tableau relatif à la manipulation

Matériel Milieu
2 pipette de 0,1 ml Les dilutions 10-1 et 10-2
Propipette 2 boites de GN à identifiés « initiales +
Vortex 10-1 et 10-2 »

- Effectuer la manipulation

3.6- Réaliser un isolement en boîte de Pétri par la méthode des quadrants à

partir d’une colonie sur milieu solide ou à partir d’un Bouillon.

- Compléter le tableau relatif à la manipulation

Matériel Milieu
1 pipette pasteur boutonnée Les dilutions 10-1 et 10-2
Vortex 1 boite de GN à identifiés « initiales +
date + milieu»

- Effectuer la manipulation

11
 TP MICROBIOLOGIE M56
BTSA STA : LES METHODES D’ENSEMENCEMENT

Notes

12