MBIO0301

Microbiologie Générale 2
TRAVAUX PRATIQUES

Licence BBTE 2ème année

1
 INTRODUCTION : Règle de sécurité

Conduite à respecter en salle de TP de microbiologie

Chaque étudiant est responsable de lui-même et des autres.

Il est important de manipuler avec le plus grand soin, en gardant à l’esprit le danger toujours présent
qu’entraîne l’utilisation de cultures microbiennes.

- Le port de la blouse est obligatoire. Elle doit être PROPRE, en COTON et à manche longue. Le port du masque en COTON est
obligatoire également. Les masques jetables ou avec des matières plastiques sont proscrits.

- Il est interdit de manger ou de boire dans la salle de TP. En règle générale, ne rien porter à la bouche pour éviter d’ingérer
des germes. Si vous avez besoin de vous restaurer ou de boire, lavez-vous les mains, puis sortez de la salle (après en avoir
demandé l’autorisation à l’enseignant !!) ; valable pour les cigarettes !

- Il est interdit de chahuter dans la salle. La présence de becs Bunsen augmente le risque de brûlures ou d’incendies. La présence
de germes en culture augmente le risque de contamination.

- Enfin, signalez immédiatement au responsable tout incident ou accident éventuel. Ex projection de culture dans
l’œil, tube de culture cassé, malaise, brûlure…. En cas de blessure (piqûre, coupure), désinfecter immédiatement
avec de l’alcool à 70°. Il peut être nécessaire de passer la blessure à l’eau dans un premier temps.

Consignes à respecter lors des manipulations

- Se laver les mains au savon au début et à la fin de chaque séance (et pour être rigoureux avant et après chaque manipulation).
Si nécessaire se désinfecter les mains avec de l’alcool. Si vous touchez du matériel utilisé par une autre personne avant vous,
mettez de l’alcool sur un papier jetable et nettoyer l’objet. Même chose pour les boutons du microscope par ex.

- Nettoyer la paillasse à l’eau de Javel au début et à la fin de chaque séance.

- Préparer son plan de travail pour les manipulations, en écartant tout produit ou matière inflammable (papier, trousse, sac,
pissette d’alcool...) et en installant le matériel nécessaire à la manipulation (bec Bunsen, pot d’eau de Javel, portoir, matériel
de pipetage…)

- Attacher les cheveux longs et manipuler assis. Vous manipulez près d’une flamme, les cheveux brûlent très facilement et très
vite surtout si vous êtes debout au-dessus de la flamme ! Attention le masque peut vous gêner pour voir la flamme ! Rester
vigilant devant le bec Bunsen !

- Identifier tous milieux ensemencés, le N° de poste, la date, le nom du micro-organisme quand il est connu ou le
nom de la manipulation.

Manipulations stériles : Travailler dans une zone sans courant d’air. Utiliser toujours un matériel stérile pour
manipuler les cultures de germes (matériel à usage unique ou flamber à la flamme). Manipuler uniquement dans
la zone de stérilité du bec Bunsen ou du PSM (poste de sécurité microbiologique).

Manipulations des germes en TP : Ne jamais ouvrir un milieu de culture inoculé hors de la zone stérile de la flamme.
Eviter les déplacements inutiles. Tout matériel mis en contact avec des germes doit être désinfecté après utilisation
(trempage à l’eau de Javel ou passage à la flamme) et avant d’être jeté (pour les « consommables »).

- Enfin, la salle doit être nettoyée avant votre départ. Vous devez nettoyer ou désinfecter les paillasses, tables,
sols ou appareils (microscope, étuve) que vous avez touchés, salis ou souillés par des micro-organismes et jeter
les différents déchets occasionnés, lors de la séance, dans les poubelles adéquates. Poubelle à autoclave, poubelle
à verre, poubelle à papier et poubelle pour le reste.
UE MBIO0301

2
TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE PREMIERE SEANCE (2h00)

I. Exercice de stérilité :

Une des bases de la microbiologie est d’être capable de manipuler en condition stérile, afin de conserver uniquement le micro-
organisme à étudier ! La manipulation proposée ci-dessous va vous permettre de vérifier que vous êtes capables de conserver
un milieu stérile après ensemencement d’une eau stérile en guise d’inoculum.
Pour s'assurer de votre rigueur à manipuler stérilement, chaque étudiant va effectuer l'exercice suivant :

Dans la zone de stérilité du bec Bunsen :

Déposer 3 gouttes d'eau stérile à l’aide d’une pipette Pasteur (soit environ 100µl) au centre d’une boîte de gélose nutritive
(GN).
Avec un étaloir (ou râteau) stérile, répartir l’eau de façon uniforme sur toute la surface de la gélose par des
mouvements de rotation. Continuer ces mouvements jusqu'à ce que tout l'échantillon soit absorbé par la gélose
(c’est à dire lorsque l'étaloir ne glisse plus aussi aisément sur la gélose).
Cette opération doit être réalisée rapidement, car la boîte est ouverte et donc sensible à la contamination ambiante.
Placer la boîte de gélose nutritive ensemencée à l’étuve à 30°C, pendant 24 à 48 h.

II. Identification d’une souche bactérienne inconnue (partie 1) :

Durant les 4 séances de TP de MBIO 0301, grâce à différents tests et examens, vous allez identifier une bactérie
à partir d’un bouillon de culture, qui vous est attribué au TP1. Vous devrez donc conserver les différents résultats
obtenus, à chaque TP sur une feuille « résumé », afin d’en faire le bilan dans le Compte-rendu du TP4.

1. Isolement d’une souche bactérienne :

A partir du tube de culture bactérienne qui vous a été attribué :
Réaliser, sur une gélose de Mac Conckey (MC) et sur une gélose de Chapman (CH) un étalement selon la
méthode des quadrants dans le but d’obtenir des colonies isolées. Chaque colonie étant issue d’une cellule unique
qui a généré des millions de clones, vous pourrez lors d’une prochaine étape isoler une culture pure.
A partir de cette culture pure, vous pourrez ensuite réaliser des études morphologique et biochimique de
la souche à identifier.
La méthode des quadrants consiste à réaliser des stries à la surface d’une gélose en boîte de Pétri, à l’aide d’une
pipette Pasteur (ou anse de platine) trempée dans un inoculum. Les stries doivent être très nombreuses, le succès d’un
isolement dépend de leur nombre, mais aussi de la bonne réalisation des étapes de la technique.

dépôt initial
1 2
4 3
Méthode des quadrants
- A l’aide d’un feutre indélébile, faire une croix sur le plastique de la boîte
de Pétri (côté gélose) pour partager le fond de la boîte en 4 secteurs
égaux.
- Après avoir mélangé le tube de bouillon contenant la souche à
identifier, tremper une pipette Pasteur boulée stérilisée à la flamme et
refroidie, dans le bouillon. NE PAS CASSER LA POINTE DE LA PIPETTE !
- Réaliser une première strie en zigzag dans les quarts de boîte 1 et 2, de
l’extérieur vers l’intérieur de la boîte.
- Puis, après avoir tourné la boîte d’un quart de tour,
- Réaliser de nouveau des stries de l’extérieur vers l’intérieur dans les
secteurs 2 et 3, puis refaire la même chose dans les secteurs 3 et 4.
Refermer la boite et la conserver à l’envers.
- les boîtes sont incubées en fin de séance, en position inversée, à l’étuve
à 37°C pendant 24h.

3
2. Technique d’ensemencement en stries

Il existe différentes techniques d’ensemencement pour obtenir une culture pure sous forme de colonies. Vous allez
ensemencer votre souche à identifier sur un milieu nutritionnel non sélectif, pour conserver la souche pour la poursuite de
l’étude, comme indiqué ci-dessous.

- A l’aide d’une pipette Pasteur

boulée (pointe non cassée), repiquer
en stries sur une gélose nutritive
(GN), la culture bactérienne à
identifier. Faire de nombreuses stries
serrées.
- Incuber la culture en fin de séance,
à l’étuve à 37°C, en position
Ensemencement en stries renversée, pendant 24 à 48 h.

3. Etude morphologique du microorganisme - examen microscopique des cellules bactériennes

Réaliser un examen à l’état frais à partir de la culture qui vous a été attribuée, comme expliqué ci-dessous.
Puis faire un dessin de cette observation sur la feuille de compte-rendu (CR). Cette étude donne des informations sur
la forme des cellules, leur mobilité et leur mode de regroupement éventuel. Donner les caractéristiques de vos
cellules.

Examen à l’état frais

• Lorsque le micro-organisme à examiner est dans un bouillon (milieu liquide)
Prélever stérilement à la pipette Pasteur 2-3 gouttes de bouillon après avoir bien homogénéisé le bouillon.
Déposer au centre d’une lame parfaitement propre, dégraissée à l’alcool. Recouvrir le dépôt d’une lamelle.
Observer grossissement x400 (ou x1000 avec huile à immersion) selon l’indication de l’enseignant.
Montrer l’observation à l’enseignant pour être noté. Faire un dessin et description sur la feuille de CRTP1

VOUS ETES RESPONSABLE DE VOS CULTURES !

C’est donc à vous de vous assurer que tous les ensemencements ou expériences effectuées ont été réalisées. Regrouper les
géloses, tubes de culture.

Vérifier que chaque boîte ou tube sont bien identifiés (Poste X, Nom de la manip ou du micro-organisme, date, heure,
initiales de la personne).

Mettre un scotch autour des boîtes afin de les conserver groupées et les retrouver plus facilement à la prochaine séance.
Placer les différentes cultures à l’endroit approprié (étuve, tiroir, réfrigérateur…) selon les indications du fascicule ou celles
données par l’enseignant.

4
UE MBIO0301

TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE DEUXIEME SEANCE (3h00)

I. Lecture des résultats (résultats à noter sur feuille de Compte-Rendu)

Vous devez avoir en votre possession les cultures réalisées au TP1 suivantes : 1 gélose de Mc Conkey, 1 gélose de Chapman et
3 géloses GN (1 pour bactéries à identifier et 2 tests de stérilité).
Faire noter par l’enseignant l’exercice de stérilité, la gélose de Mac Conkey (MC) et la gélose de Chapman (CH)
Isolement d’une souche bactérienne : Observer, interpréter les résultats obtenus sur milieux Mac Conkey et Chapman.
Description des aspects macroscopiques des colonies obtenues sur milieu solide (GN).

Notez le résultat obtenu, sur votre feuille « résumé » et dans le CRTP, il vous servira pour le bilan à réaliser au cours du TP4.
Référez-vous aux documents fournis sur moodle (milieux de culture, groupes bactériens) et au TD1 sur l’identification.

II. Identification d’une souche bactérienne inconnue (partie 2) :

1. Détermination du GRAM
L’identification d’une bactérie passe par la détermination du GRAM qui peut se réaliser soit par une coloration des cellules
bactériennes et un examen microscopique (coloration différentielle de GRAM), soit par un test chimique (test à la potasse),
que vous allez réaliser.

Test à la potasse

- Sur une lame en verre propre, déposer une goutte de potasse (KOH 3%) avec une pipette Pasteur non stérile ouverte (POINTE
CASSÉE)
- Prélever stérilement, à l’aide d’une öse, une colonie à partir de votre boite GN contenant la souche à identifier
- Mélanger la colonie dans la goutte de potasse (env. 20 sec) et soulever doucement l’öse de 1 à 2 cm, afin de voir si un filament
se crée ou non.
- Noter le résultat obtenu sur votre compte-rendu de TP et sur la feuille « résumé », pour le bilan à réaliser au cours du TP4.

Bactérie GRAM - : formation d’un filament (mélange visqueux)

Bactérie GRAM + : absence de filament

2. Enzymes « respiratoires » :
a. Le test de la catalase
Il permet de détecter la présence de la catalase qui convertit l’eau oxygénée, en eau et O2.

- Déposer ou faire déposer (selon les instructions de l’enseignant) sur une lame en verre propre, une goutte d’eau
oxygénée.
- A l’aide de l’anse, vous prélèverez une colonie isolée à identifier et vous la déposerez dans la goutte d’eau
oxygénée.
Observer et noter le résultat : l’apparition de bulles d’air indique une réponse positive ; un test catalase négatif est
indiqué par l’absence de bulle.
- Notez le résultat obtenu sur votre compte-rendu TP et sur la feuille « résumé », pour le bilan à réaliser au cours
du TP4.

b. Le test de l’oxydase
Il permet de détecter la présence de cytochrome c oxydase, capable de réduire l’O2. Il existe plusieurs systèmes pour la mettre
en évidence. Ci-dessous le test à réaliser.

- Prendre un disque de papier imprégné de réactif N-diméthyl-paraphénylène diamine à l’aide d’une pince en
plastique et déposez-le sur une lame en verre propre (mettre sur la même lame que le test catalase)
- Etaler sur ce disque, une colonie isolée prélevée à l’aide d’une pipette Pasteur (ne pas prendre l’anse en métal,
cela fausserait la réponse au test).
- Observer le virage de couleur et noter le résultat : Le test est positif lorsqu’une couleur violette apparaît dans les
10 secondes au maximum ! Attention après un temps plus long, le test peut s’oxyde tout seul.
- Notez le résultat obtenu sur votre compte-rendu TP.

5
3. Mise en évidence du type respiratoire

Milieu régénéré Viande-Foie (VF)

Ce milieu permet d’étudier le comportement des bactéries vis-à-vis de l’oxygène. Le milieu gélosé viande-foie est
réparti en tube ce qui permet de créer en profondeur des conditions d’anaérobiose. Il existe un gradient d’oxygène
croissant, du bas vers le haut du tube.

- Régénérer le tube de VF au bain-marie bouillant pendant 20 minutes afin d’éliminer l’oxygène dissous
- Laisser le refroidir sur la paillasse à ~ 45°C (jusqu’à ce que vous puissiez prendre le tube en main).
- Ensemencer stérilement votre souche à identifier à l’aide d’une pipette Pasteur boulée stérile (pointe non
cassée) en enfonçant la pointe le plus loin possible dans le fond du tube, puis en remontant en décrivant
des tours de spires très serrées. Aussitôt l’ensemencement fait, déposer le tube dans un bécher rempli
d’eau froide (« eau du robinet ») afin d’éviter une diffusion trop rapide de l’oxygène dans le milieu.
- Incuber à 37°C pendant 24h.

4. Etude de l’influence de la température sur la croissance de la souche à identifier

Le but de ce travail est de déterminer, une zone de température dans laquelle on observe la meilleure croissance du micro-
organisme, en le cultivant sur gélose ordinaire. Les températures testées sont comprises entre 4°C et 55°C (4°C, 25°C, 30°C,
37°C et 55°C) pendant 24h. Vous ne testerez que 2 températures. Les autres résultats de cultures vous seront donnés par
l’enseignant.

- Réaliser une suspension bactérienne avec votre souche en prélevant une colonie (ou fraction de colonie, si
celle-ci est très grosse) que vous mettrez dans un tube d’1mL d’eau stérile.
- Prélever une boucle d’anse de platine de ce bouillon et ensemencer stérilement, en stries, sur les deux
géloses nutritives.
- Incuber dans les étuves une boite à 30 et une boite à 37°C pendant 24 h