Chapitre III : Les conditions de travail en asepsie Dr Manel BOUDOUAYA 2017/2018

Chapitre III Sommaire

Les conditions de travail en asepsie
I. Techniques générales
I.1. Point de départ
I.2. Stérilisation des milieux
I.3. Désinfection des explants

I. Techniques générales
I.1. Point de départ
Le terme aseptique désigne l'absence de tout agent infectieux. L'asepsie est le fait
d'avoir débarrassé un milieu quel qu'il soit de tous les germes qui pouvaient l'infecter.

I.2. Stérilisation des milieux

I.2.1. Manipuler stérilement

1) Avant toute manipulation, se laver soigneusement les mains puis les passer à l'alcool
à 70° et les laisser sécher.

2) Nettoyer la paillasse à l'alcool à 70° ou à l'eau de Javel, ainsi que tout le matériel que
vous allez utiliser.

3) Afin de maintenir une zone de manipulation stérile, vous utilisez un bec Bunsen. Il
va en effet permettre de détruire localement et de manière immédiate, grâce à la chaleur, les
micro-organismes se trouvant sur les objets manipulés et dans l’air ambiant.

4) Placer le bec Bunsen au milieu de la paillasse et à 20 cm du bord, il doit être devant

vous lorsque vous manipulez.

5) Pour allumer votre bec Bunsen, vérifier que le gaz est allumé et que le bec Bunsen
est posé bien à plat, éloigner toute matière inflammable (n’oubliez pas de retirer vos
écharpes, et d’attacher vos cheveux).

6) Craquer une allumette et l’approcher de la cheminée, à quelques centimètres au-dessus

pour éviter que la flamme ne soit soufflée.

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7) Ouvrir le robinet d'arrivée du gaz (attention sur certain bec Bunsen il y a deux arrivées
à ouvrir : robinet jaune et petit robinet au niveau du bec), puis à l'aide de ce robinet régler
son débit pour obtenir une flamme qui ne dépasse pas 8 à 10 cm de hauteur. Vous obtenez
une flamme jaune (chauffage modéré). Tourner ensuite la virole pour obtenir une flamme
chauffante, non éclairante, non bruyante. Un cône bleu clair doit se former, c’est la
flamme bleue (chauffage maximum). C'est à son extrémité que la flamme est la plus chaude
(jusqu'à 1 500°C).

1 500°C

Figure III.1. La flamme jaune (chauffage modéré) et la flamme bleue (chauffage maximum)

L'échauffement de l'air autour de la flamme assure une zone de convection de 10 à 15

cm autour du bec dans laquelle l'air est stérile. C'est dans cette zone qu'il faut se situer
pour travailler.

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10 à 15 cm

10 à 15 cm 10 à 15 cm

Zone stérile

Figure III.2. La zone stérile

NB. Toutes les manipulations nécessitant des conditions aseptiques sont réalisées dans
le volume stérile de 10-15 cm autour du bec, dont la flamme du bec Bunsen constitue
la base

8) Placer dans la zone stérile, délimitée par un cercle d'une vingtaine de

centimètres de rayon autour du bec Bunsen, le matériel à utiliser (instruments,
flacons, etc.).

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Instruments
Bec
Bunsen

Figure III.3. Instruments à utiliser près du volume stérile

9) Stériliser le matériel métallique par flambage à l'alcool à 90° avant chaque

utilisation. Les tubes et les flacons utilisés pour réaliser des cultures ont été passés à
l'autoclave à 120 °C pendant une demi-heure ou stérilisés dans le panier d'une cocotte-
minute contenant un demi-litre d'eau.

Bec 1 Bec 2

Figure III.4. Travail entre deux becs Bunsen et stérilisation du matériel par flambage à l'alcool

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10) Les tubes et les flacons, tenus obliquement seront débouchés, ouverture vers la
flamme, auront leur goulot1 passé à la flamme avant et après chaque utilisation et le bouchon
sera passé à la flamme avant d'être reposé sur le flacon. En règle générale la main gauche
apporte le matériel à la main droite qui tient l'instrument de prélèvement ou d'ensemencement,
ou qui manipule le scalpel ou la paire de ciseaux.

Bec Bunsen

Figure III.5. Ouverture et fermeture des flacons (passage du goulot à la flamme)

11) Les instruments seront fréquemment passés à la flamme après avoir été trempés dans
un petit bêcher contenant de l'alcool à 90° et seront maintenus dans le plateau situé dans la
zone stérile quand ils ne sont pas utilisés.

12) Un couvercle de boîte de Pétri est prévu pour pouvoir éteindre le flacon d'alcool au cas
où il s'enflammerait.

13) Au cours des manipulations, éviter de bouger et de parler pour ne pas projeter de
micro-organismes et ne pas porter les mains à la bouche. On peut également porter un
masque couvrant le nez et la bouche, mais ce n'est pas strictement indispensable.

14) Se laver soigneusement les mains après les manipulations.

1
Le goulot : partie supérieure de la bouteille, généralement plus épaisse pour empêcher la
pression du liège de briser la bouteille en verre.

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15) Après les manipulations, tout le matériel contaminé devra être désinfecté à l'eau de
Javel avant d'être lavé ou jeté s'il s'agit de matériel à usage unique.

En effet, La réussite de toute manipulation de culture in vitro est conditionnée par la

parfaite asepsie du matériel et des milieux utilisés. Toute dérogation aux règles précédentes a
les plus grandes chances de se traduire par des contaminations des cultures rendues ainsi
inutilisables. Il est donc absolument impératif de suivre ces règles.

I.3. Désinfection des explants

Toutefois, il faut noter que cette étape s'effectue selon la technique de multiplication
utilisée et la partie choisie de plante.
1) Sélectionner de jeunes rejets2 issus de plantes mères en bonne santé et ayant déjà fleuri.
2) Détacher le jeune plant de la plante-mère de très près sans l'abîmer.
3) Puis, avec un couteau bien affuté, couper la partie externe du rejet sélectionné et le
rincer dans de l’eau distillée.
4) Avec un couteau enlever les feuilles autour du méristème externe, jusqu’à ce qu’il ne
reste que 3 feuilles.
5) Découper des jeunes rejets avant leur désinfection.
6) Pour désinfecter les explants, lavez-les avec de l’eau du robinet et du savon très
soigneusement.
7) Puis les rincer avec de l’eau distillée.
8) Les plongez dans du chlorure mercurique (HgCl2)3 à 0,1 % et 0,1 ml de Tween 80
(polysorbate 80 : C64H124O264) durant 10 minutes.

2
Un rejet est une plantule qui apparaît sur une tige, un rameau ou à la base d'une
plante. Un drageon est également une plantule mais qui, cette fois ci, va naître à
partir de la racine d'une plante. Dans ce cas, on dit que la plante drageonne. Le
drageon est un rejet souterrain (dit stolon souterrain) qui naît de la racine (ou
proche de la racine) de la plante. De nombreuses plantes se reproduisent ainsi :
rosier, noisetier, framboisier, lilas, … La pomme de terre émet également des
drageons, dont les extrémités se transforment en tubercules.

3
Le chlorure de mercure est bien connu pour son utilisation comme conservateur. Le
rôle principal du bain de chlorure de mercure est d'augmenter la durée de
conservation des explants.
4
Le polysorbate 80 est un émulsifiant/solubilisant, utilisé le plus souvent pour
disperser les huiles dans de l’eau, il permet de ne pas avoir cette pellicule
huileuse qui reste habituellement à la surface.

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9) Puis les rincer très soigneusement dans de l’eau distillée à cinq reprises (voir annexe 2
TP Le processus de multiplication de jeunes rejets de bananiers).

Figure III.6. Disposition du plan de travail et premières opérations

Photo III.2. Rejet de souche de peuplier à la suite d'une coupe

Au sens botanique, un rejet (tout nouveau « jet », terme ancien signifiant « pousse ») est une
nouvelle pousse feuillée apparaissant sur une plante ligneuse à la suite d'une cassure
naturelle ou d'une coupe d'origine anthropique.

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Photo III.1. Détachement du jeune plant de la plante-mère

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