Ubiquité des

microorganismes

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 Ubiquité: généralités

◼ Déf: capacité d’être présent en plusieurs

endroits à la fois

◼ Monde microbien:
 Divers: + et –
 Partout: + et –
 Invisible

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 Ubiquité: généralités (suite)
▪Labo clinique : identification et dénombrement
▪Industries alimentaires : identification et
dénombrement → respect des normes
 éviter présence
repérage des sources potentielles de contamination
→protection du manipulateur
→protection des échantillons (contamination, croissance)

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 Repérage: règle des 5M
Le monde microbien est divers et présent partout
➔ les contaminations peuvent provenir de
nombreuses sources

MATIERES MAIN
PREMIERES D'OEUVRE

METHODE MATERIEL

MILIEU
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 1) Main d'œuvre
◼ Porteur (naturellement)
 tube digestif
➔ bouche → salive → postillons
(gouttelettes de Pflügge) (108 µorg /ml)
➔ matières fécales → mains
 peau → mains (104 à 108 µorg / cm²)
 système respiratoire ➔ bouche et
nez → postillons et éternuements
 cheveux
 objets → bijoux, lunettes, …

◼ Vecteur → déplacements
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 Exemples
◼ Cuir chevelu → 1.5 * 106 µO/cm2
◼ Mains → 2 * 103 µO/cm2
◼ Salive → 106 - 108 µO/ml
◼ Eternuement → 107 µO/ml
◼ Mouvement de bras, tête, mains → 106 µO
◼ S’asseoir → 2.5 106 µO

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 2) Matériel
Tout ce qui peut entrer en contact avec le produit,
l'échantillon ou le personnel
◼ Locaux ➔ paillasse,…
◼ Outils
➔ en entreprise : couteaux, spatules, tournevis, ...
➔ au labo : verrerie, pipettes, boîtes de Pétri, öse,…

◼ Milieux de culture
◼ Eau
◼ Objets divers (téléphone!, feuille, bics, clavier, …)

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 3) Milieu
Air environnant

Les aérocontaminants
•libres
•adsorbés

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 4) Méthode
Façon de travailler Protocole d'analyse, BPL

◼ CONTAMINATION (contact)
➔  Flux
◼ des échantillons
◼ du matériel

◼ de la main d'œuvre

◼ MULTIPLICATION
➔  Incubation
◼ Température
◼ Temps de séjour 9
5) Matière première

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Préventions des
contaminations

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 Définitions
◼ Désinfection :
 élimination dirigée de germes…
◼ Stérilisation :
 suppression de toute forme de vie…
→ « Loi de la durée »: temps de contact min.
→ « Loi de la température »
→ « Loi de la concentration » (du produit utilisé)
→ « Loi relative aux inhibiteurs »
http://www.md.ucl.ac.be/didac/hosp/cours/HH5.htm

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 1. Prévention des contaminations
liées au MATERIEL
= Tout ce qui peut entrer en contact avec le
produit, l'échantillon ou le personnel

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 1.1. Traitements thermiques
(stérilisation)
◼ Chaleur sèche
 Flamme : bec bunsen
◼ Öse, col des tubes en verre!
col des bouteilles,…

 Fours et Poupinels
◼ Matériel sensible aux hautes pressions
et/ou à l’humidité : céramique,
médicaments,…
◼ Barèmes : Minimum 60’ à 170°C
30’ à 180°C
!! Agents Transmissibles Non
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Conventionnels !!
 1.1. Traitements thermiques (suite)
◼ Chaleur humide

➢ Ebullition: longue
➢ Certains milieux
➢ Sporulés résistants !!

➢ Autoclavage : 15’ à 121°C (= 2atm)

 Matériel supportant ces t° et pression :
metal, verrerie, milieux...
Sporulés détruits

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 1.2. Filtration (stérilisation)
◼ Membranes filtrantes
✓ Épaisseur : 0.1 mm
✓ Porosité : 0.2 µm

➢ Bactéries: 1 à 3 µm

 solutions de substances thermosensibles

(matériel) : certains milieux de culture,
antibiotiques…

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 1.3. Radiations (stérilisation)
◼ UV (10<<400 nm)
✓ Faible pouvoir pénétrant  traitement de
surfaces (matériel) et d’air (milieu) dans des
enceintes fermées
✓  ~ 260 nm

◼ Rayonnements ionisants 
(10-2 nm<<1 nm)
✓ Grand pouvoir pénétrant
✓ Matériaux sensibles à la chaleur (boîtes de
Petri, pipettes…) et aliments
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 1.4. Liquides (désinfection)
◼ Composés phénoliques (Dettol®)
 Désinfecte

◼ Alcools (éthanol 70%, Norvanol) : non sporicides

 Paillasse

◼ Cl et dérivés chlorés (eau de Javel)

 Pots de décontamination

-> Dégraisse !! Nettoyage préalable !! 19

 2. Prévention des contaminations
de la MAIN D’OEUVRE
Enlever bijoux, faux ongles, avoir des ongles courts
+
Nettoyage des mains et avant-bras
→ Hibiscrub: Désinfecte – Dégraisse
+
Tablier propre (haute t°)
(en principe ne doit pas sortir du laboratoire)
+
Cheveux attachés, voiles relevés

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 3. Stérilisation du MILIEU air

▪ Bec bunsen (flamme bleue!!):

mouvement ascendant + chaleur
!!! Eviter turbulence, courant d’air !!

10cm

20 cm 20 cm 21
 3. Stérilisation du MILIEU (suite)

▪ Hotte à flux laminaire

✓ Enceinte fermée
✓ Air « stérilisé » par filtration (0.3 µm)
✓ Ecoulement laminaire (évite turbulences)

! Ne stérilise pas les objets !

 Hotte + UV

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4.Travail aseptique (METHODE)
◼ Travail près de la flamme du bec bunsen
◼ Ouverture d’un seul récipient à la fois
◼ Ouverture des boites et inclinaison des
récipients à 45°
◼ Couvercle face à la paillasse
◼ Flamber le col des tubes après ouverture et
avant fermeture (ascendance de l’air +
chaleur)
◼ Boîtes de Petri à l’envers
◼ Barème de stérilisation
◼ …
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Visualisation des
microorganismes

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 µO invisibles à l’œil nu

 augmentation de leur « taille » pour les

visualiser, compter, identifier,…

Agrandissement Agrandissement
optique biologique (MILIEU
(MICROSCOPE) DE CULTURE)

1 UFC = unité formant 1 colonie

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 Culture des µO
Agrandissement biologique
= faire en sorte que chaque cellule puisse se
multiplier suffisamment pour donner un
signal de sa présence (UFC)

Milieu de culture Milieu LIQUIDE 

SOLIDE  colonie virage du milieu

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 Techniques de
prélèvement, de repérage
des µO

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 Boîtes contact = boîtes RODAC

1) Ouvrir la boîte près de la zone à tester

(surface plane), maintenir le couvercle face à
la paillasse
2) Appliquer la gélose sur la surface
3) Refermer la boîte immédiatement après
4) Mettre à incuber à 37°/ 24h/aérobiose

28
Boîtes contact = boîtes RODAC

29
 Ecouvillonnage
1) Ouvrir l’emballage stérile, côté « bois »
2) Ouvrir le tube d’eau stérile (45°, bouchon face paillasse)
3) (Stériliser le col du tube)
4) Tremper l’écouvillon et l’essorer
5) (Stériliser le col du tube)
6) Fermer le tube
7) Effectuer le prélèvement
8) Ouvrir la boîte à 45°
9) Frotter l’écouvillon sur la gélose
10) Fermer la boîte Ecouvillons
11) Mettre à incuber à 37°C/ 24h/aérobiose stériles
→ Délimité un carré de 10*10cm
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 Biocollecteur
◼ Mise en évidence des aérocontaminants
◼ Biocollecteur = aspirateur d’air de volume
choisi

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 Biocollecteur: mode opératoire
1. Positionner le préleveur d’air sur une surface stable
2. Mettre en route l’appareil → bouton "ON/OFF"
3. Sélectionner le volume souhaité avec le bouton "VOL"
4. Dévisser le crible et positionner la boîte de Petri sans
couvercle. Revisser le crible.
5. Démarrer la prise d’échantillon d’air par une pression
sur le bouton « START/STOP »
6. Dès que le prélèvement est réalisé, l’appareil émet un
bip sonore de fin, dévisser le crible et enlever la boîte
de Petri de l’appareil. La refermer.
7. Mettre en incubation 48-72h à 30°C, en aérobiose.
→ résultat par unité de volume
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 Manip
Par binôme :
- 2 RODAC → choix 1 surface PLANE
- 1 RODAC avant désinfection et 1 RODAC après désinfection
- 1 boite de Petri divisée en 2 → choix 1 surface PLANE
- ½ avant / ½ après désinfection avec Ethanol 70% (écouvillonnage)
- 1 boîte de Petri divisée en 2 → empreinte de doigt
- ½ avant et ½ après désinfection Gel Hydro-alcoo. ou Hibiscrub
- 1 boîtes de Petri → au choix
- prélèvement avec écouvillon (surface au choix)
- empreinte objet
- …
◼ Annotation boîtes (groupe, initiale, n°boîte) COTE GELOSE !!!!
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◼ Incubation 24h, 37°C, aérobiose, gélose vers le haut
 Que tester ?

◼ Empreintes de doigts
◼ Empreintes de bijoux
◼ Empreintes de (paillasse), GSM, porte,…
◼ Ecouvillonnage de dents, du robinet,…
◼ Dépôt d’un cheveu
◼ …

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 Analyse résultats JOUR 2
Analyse quantitative uniquement pour les
AVANT/APRES (RODAC, empreinte doigt et
écouvillonage avant/après)

Calcul efficacité en % =

(Nombre de colonies avant - nombre de colonies après )*100

nombre de colonies avant

• Min 90% d’efficacité pour une désinfection efficace !

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 Analyse résultats JOUR 2
• Analyse qualitative des UFC
• Taille : petit, moyen (2-3 mm), grand (5 mm)
• Aspect : rugueux/lisse ; brillant/mat ; poilu ?, ...
• Couleur: jaune, blanc, gris, rose, ...
• Relief: plat, bombé, incurvé,...

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