RAPPORT

DE MICROBIOLOGIE

REALISE par: PROF:

-Pr.Hamdali

.. ANAS TASSAOUI GROUPE:8 -Pr.Bensaleh

-Pr.Kama
SALAH EDDINE ZAKRITE BCG S4

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 PLAN

 Introduction générale sur la microbiologie

 TP1 :Notions et techniques de base en microbiologie :
 les milieux de culture
 la stérilisation, l’isolement et l’incubation
 les manipulations stériles
 TP2 :Observation des micro-organismes macroscopiquement et
microscopiquement
 TP3 :Dénombrement bactérien sur milieu solide et sur milieu liquide

Introduction générale sur la microbiologie

Partie de la biologie qui a pour objet l'étude des micro-organismesà partir

des méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier,
Autrement dit, est une sous-discipline de a biologie basée sur l’étude des
micro-organismes et des relations avec leur environnement.

Le but fondamental de ces séances de TP est de Se familiariser avec un

laboratoire de microbiologie, son équipement et son fonctionnement.

Il existe plusieurs domaines que la microbiologie traite, comme :

 Domaine biomédicale :
C'est une branche de la médecine qui focalise sur le diagnostic d'une
maladie infectieuse, par l'isolement et identification des agents infectieux
dans les prélèvements d'origine humaine.
 Domaine agriculture :
La microbiologie agricole est essentielle à la protection de
l'environnement, à l'amélioration des rendements, à la production de
denrées saines et à l'obtention d'une agriculture durable.

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 TP1 : Notions et techniques de base en microbiologie :

Règles a suivre durant les travaux pratiques de microbiologie :

- Port de la blouse
- Se laver les mains.
- Flambage des instruments(Anse de platine…)
- Laisser refroidir anses et pipettes environ 10 secondes avant tout contact avec un
liquide,une colonie bactérienne
-Flambage de l’ouverture des tubes et des flacons(coton enlevé) avant et après
chaque prélèvement ou ensemencement. Les manipuler en évitant que le liquide
touche au coton(bouchon).
….
Milieu de culture :
milieu de culture est une préparation, contenant des substances
(biologiques ou chimiques) qui reproduit un environnement (nutriments,
pH, pression osmotique) permettant à certains types de micro-
organismes de se multiplier.
Il existe des types de milieux:

 Solide:
milieu de culture est une
préparation, contenant des
substances (biologiques ou
chimiques) qui reproduit un
environnement (nutriments, pH,
pression osmotique) permettant à
certains types de micro-organismes de se multiplier,grace au Gélose nutritif qui
contient une substance extraite d’une algue rouge marine qui s’appelle l’agar-agar.

 Liquide : milieu de culture enrichi grâce à un liquide

riche en molécules organiques, permettant le
développement de microorganismes exigeants.

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 Séléctif : milieu qui permet de sélectionner un ou
plusieurs types de microorganismes. Qui seront les
seuls à pouvoir se développer sur ou dans le milieu
alors que tous les autres seront inhibés.

 Milieu synthétique : Ce sont des milieux dont on

connaît précisément la composition chimique, tant
d'un point de vue qualitatif que quantitatif

STERILISATION :
C’est une opération qui permet de tuer les micro-organismes qui existent déjà d’une
manière totale ,d’une autre manière c’est la réalisation d’aseptie (l’aseptie c’est
l’absence totale des germes) . Il existe plusieurs types de stérilisation :
STERILISATION THERMIQUE :
traitement thermique à des températures supérieures à 100°C, visant à
détruire les enzymes, les micro-organismes dans leurs formes végétatives
et sporulées et leurs toxines thermosensibles.
En microbiologie il existe deux type de stérilisation thermiques :

La stérilisation à la chaleur humide :

La stérilisation à la chaleur humide au moyen de
vapeur saturée et sous pression constitue le
procédé de stérilisation le plus fiable et le plus
facile à contrôler. Qui se consiste à l’utilisation de
l’autoclave(récipient)

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La stérilisation à la chaleur sèche :

BENSEN :
l est surtout utilisé pour stériliser les instruments (en
les passant dans la flamme) et l'atmosphère située
dans un rayon de 20 centimètres autour de la
flamme

FOUR PASTEUR :
C'est un four de stérilisation qui utilise la chaleur
sèche pour détruire les germes.

NB :
LA STERILISATION EST BASE SUR LA NATURE DU
MATERIEL , ça veut dire qu’il faut bien choisir la méthode de
stérilisation.
(VERRERIES=FOUR PASTEUR ;MILIEU DE CULTURE
LIQUIDE =AUTOCLAVE POUR MAINTENIR L’EAU DEJA
EXISTER )

STERILISATION CHIMIQUE :
L’emploi des agents chimique comme l alcool, oxyde d'éthylène…
NB :
QUELQUE PRODUITS UNIQUEMENT DESINFECTE ET PAS
STERLISE COMME L’EAU DE JAVEL.

STERILISATION PHYSIQUE :
L’emploi des rayonnement UV qui détruisent les germes.
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STERILISATION MECANIQUE :
L’emploi des filtres spéciales qui inhibe le passage des bactéries.

POSTE DE TRAVAILLE :

LES TYPES D’ENSEMECEMENT :

PAR INNONDATION
PAR STRIE …
PROFOND POUR LES BACTERIES ANAEROBIE

Manipulation :
La réalisation d’une dilution par cascade 10¯¹ à 10⁻⁶ d’échantillon de 0,1 g du sol
par l’eau physiologique, ensuite encensement par inondation dans 10 boites de
pétri, 4 étaient exposés aux une source de contamination, et 6 pour les 6 dilutions
de l’échantillon de sol.

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TP2 :OBSERVATION DES MICRO-ORGANISMES MACROSCOPIQUEMENT ET MICROSCOPIQUEMENT

CONTENU MANIPULATION
1 L’air Introduction de la gélose nutritive dans la boite, puis laissé
ouverte en dehors la zone aseptique
2 CHEVEUX Introduction du cheveux après ajout de la gélose nutritive
3 LA VOIE
RHIMAPHORYNGEES Toussement dans la boite après ajout de la gélose nutritive

4 Division de la boite en deux, ensuite la mise en contact avec la

MAINS main avec et sans désinfection

5 Le 1ér tube dilué Introduction de la gélose nutritive dans la boite, ensuite

(10⁻1) ensemencements par inondation d’un ml de dilution 10-1
6 Le 2ème tube dilué Introduction de la gélose nutritive dans la boite, ensuite
(10⁻2) ensemencements par inondation d’un ml de dilution 10-2

7 Le 3ème tube dilué Introduction de la gélose nutritive dans la boite, ensuite

(10⁻3) ensemencements par inondation d’un ml de dilution 10-3

8 Le 4ème tube dilué Introduction de la gélose nutritive dans la boite, ensuite

(10⁻4) ensemencements par inondation d’un ml de dilution 10-4

9 Le 5ème tube dilué Introduction de la gélose nutritive dans la boite, ensuite

(10⁻5) ensemencements par inondation d’un ml de dilution 10-5

10 Le 6ème tube dilué Introduction de la gélose nutritive dans la boite, ensuite

(10⁻6) ensemencements par inondation d’un ml de dilution 10-6

APRES ENSEMENCEMENT, ON PASSE A L’INCUBATION (pendant 5 jours à

37°C°)
L’INCUBATION : L'incubation est la période silencieuse, correspondant au
développement des germes.

7
1 6

2 7

3 8

4 9

5 10

8
 OBSERVATION MACROSCOPIQUE :Grace au milieu solide gélose on peut
observé macroscopiquement le développement en forme des colonies ( Masse de
cellule issue de la prolifération d’une meme cellule mère initiale), L’observation de la
colonie permet d’examiner ces caractères morphologiques (Taille, Couleur…).
Après examination, on a collecté les informations suivantes:

CONTEN TAILLE COLEUR ODEUR PLAN ELEVATION BORD OPACITE

U
1 L’air 1,1cm blanchâtre Existence Circulaire Convexe Ondule Translucide
0,4 /0,7 Irrégulière Bombée
0,5 /0,2
2 CHEVEUX 2,0cm Marron Existence Irrégulière Convexe Ondule Opaque

3 LA VOIE 0,1cm Blanchâtre Existence Circulaire Convexe Régulier Translucide

RHIMAPHO- 0,7 Orange
RYNGEES
1,1
4 0,1 /0,7 Blanchâtre Existence Circulaire Convexe Régulier Transparente
MAINS 0,2/0,6 Irrégulière Bossue Ondule
0,4cm
5 Le 1ér tube 1cm Jaune un Absence Circulaire Convexe Ondule Translucide
dilué 0,2 peu de
(10⁻1)
blanc
6 Le 2ème tube 0,2cm Blanchâtre Absence Irrégulière Plate Régulier Transparente
dilué (10⁻2) 0,8

7 Le 3ème tube 0,8cm Blanchâtre Absence Irrégulière Bossue Boucle Transparente

dilué (10⁻3) 1

8 Le 4ème tube Tapie Blanchâtre Absence Circulaire Plate Régulier Translucide

dilué (10⁻4) bactérie Un peu de Irrégulière
n jaune

9 Le 5ème tube 1,1 Blanchâtre Absence Circulaire Plate Ondule Transparente

dilué (10⁻5) 0,4 /0,3

10 Le 6ème tube 0,2 /0,7 Blanchâtre Existence Irrégulière Plate Ondule Transparente
dilué (10⁻6) 1,1 /0,5 Fila
menteurs

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OBSERVATION MICROSCOPIQUE :
 Coloration de GRAM :
C’est une coloration qui permet de mettre en évidence la forme et les 8propriétés de
la paroi bactérienne, et d’utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier ,
l’avantage de cette méthode est de donner une information rapide sur les bactéries
présents dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.
Il existe deux types de bacteries :
Les bactéries à gram négatif [ - ] :
riche en lipides, ce qui la rend perméable à l’alcool qui décolore le cytoplasme.

Les bactéries à gram positif [ + ] :

la paroi de ces gram est riche en peptidoglycanes ce qui la rend imperméable à
l’alcool et le cytoplasme reste coloré en violet.

 Réalisation du FROTTIS :
Sur une lame, on a déposé une goutte d’eau stérile, on a ajouté à
l’anse de platine stérilisée une goutte d’une colonie isolée extraite
de la troisième boite, on a la étalée et fixé avec le bec bunsen à la
chaleur à environ 40°C pendant 10 à 15 minutes. Après on a posé
la lame séché sur le portoir pour faire un bac de coloration.

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 PROTOCOLE EXPERIMENTALE DU COLORATION DE GRAM :

 Coloration par le Cristal violet :

le Crystal violet capable de pénétrer à l’intérieur et colorer les cytoplasmes (gram+
et gram-), on a coloré la lame avec ce colorant, on a la laissé 1 min et on a la rincé
avec l’eau.

 Fixation avec le Lugol :

On a déposé le Lugol pendant 1 minute pour faire fixer la couleur violette

 Décoloration avec L’alcool acétol :

on a ajouté l’alcool acétol qui est capable de décolorer les gram(-).

 Recoloration à la fuchsine :
on a ajouté la fuchsine qui est de couleur rose pour recolorer les gram (-)

 OBSERVATION MICROSCOPIQUE :

IL S’AGIT
DONC
D’UNE
COLONIE
A BACTERIE
MERE COQUE
GRAM(+)

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 TP3 :DENOMBREMENT BACTERIEN SUR MILIEU SOLIDE
ET SUR MILIEU LIQUIDE
DENOMBREMENT BACTERIEN
La détermination de la concentration en bactérie dans un échantillon par rapport à un
volume donné.
Il existe des divers types de dénombrement :

Dénombrement sur milieu solide :

Le principe de cette méthode s’appuie sur le fait qu’un micro-organismes présent dans un
produit, mis en culture dans les conditions optimales, en milieu solide convenable, s’y
développe en formant une colonie. Et le nombre des colonies dans ce milieu doit être
entre 30 et 300 colonies.
Le développement de plusieurs micro-organismes groupés peut conduire à une unique
colonie, donc il s’agit de faire correspondre un micro-organisme à une UFC (Unité
Formant Colonie). [30 < NC <300].
pour calculer le nombres de bactéries on applique
NB= 𝑁𝐶×fd/𝑉e =X UFC/ml
Avec
fd :facteur de dillution Ve :volume ensemencé(1ml)

Dénombrement sur milieu liquide :

Le dénombrement de cellules bactériennes dans un milieu liquide en se basant
sur la croissance des cellules bactériennes par une unité de volume. C’est une
méthode statistique d’estimation du nombre le plus probable(NPP) appelée
technique de Mac Crady, rencontres dans un échantillon donnée et par rapport à
une unité de volume.

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MANIPULATION :
On a fait une dillution en cascade(10-1 à 10-6) d’une solution mère contenant un
échantillon de 0,1 g du sol et l’eau physiologique. Ensuite on a ensemencer par
inondation 1ml de chaque dilution dans 6 boites a pétri qui contient de la gélose nutritive,
puis on a introduit trois fois de chaque dilution 1ml dans 18 tubes (chaque 3 tubes pour
une seule dilution) contenant la bouillon nutritif.
Apres incubation : (solide)

BOITE IMAGE BOITE IMAGE

1 4

2 5

13
 3 6

Après la fin de incubation en observe les résultants présents dans le tableau suivant:

Dilution 10•-1 10•-2 10•-3 10•-4 10•-5 10•-6

NB >300 >300 >300 >300 54 11

Pour le dénombrement bactérien il faut vérifier deux lois

1ere loi : 30 ≤ n ≤ 300 (valider pour dilution 10•-5)
2eme loi : Notion de DN N=n*Fd/Ve
n :nbr noyau du comptages des CB dans les différentes répétitions/dilution X
Fd :Facteur de dilution(Fd=1/d)
Ve :Volume ensemence

AN : N=54*10•5/1 alors N=54*10•5 UFC/ml

Apres incubation : (liquide)

TUBES IMAGE TUBES IMAGE

123 456

Après la fin de incubation en observe les résultants présents dans le tableau suivant:

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 Dilution 10•-1 10•-2 10•-3 10•-4 10•-5 10•-6

Résultats +++ +++ +++ +++ +++ ---

Nbr de 3 3 3 3 3 0 0
tubes

NC=300

On a NC=300 alors après tables de Mac Grady on a NPP=2,5

Notion du dénombrement bactérien : N=NPP*Fd/Ve

AN : N=2,5*10•5/1 alors N=2,5*10•5 C/ml

Conclusion :
Normalement le milieu liquide doit contenir plus des bactéries que milieu
solide puisque le milieu liquide permet le comptage des cellules mortes et
vivantes, par contre les résultats de notre TP.

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