TD Bactériologie 1

I / Travail en conditions aseptiques

Il faut éviter de se contaminer avec les bactéries, et éviter de contaminer les échantillons.

On manipule dans une zone de 30cm autour de la flamme bleue (la plus chaude : 1500°C).

L’oese sert à prélever les échantillons solides. On la passe dans la flamme bleue pour faire rougir le
fil : l’oese est alors stérile. On la laisse refroidir 10 secondes dans la zone stérile, avant de s’en servir.

La pipette Pasteur sert à prélever les échantillons liquides. Pour la stériliser, on l’autoclave. On
prendra une pipette dans un bocal, toujours dans la zone stérile de 30 cm. Le coton protège la poire
qu’on rajoutera. On prend une pince de trousse de dissection, on la stérilise 2 secondes dans la
flamme, puis on casse le bout de la pipette pour l’ouvrir.

Pour stériliser un milieu de culture, on fait un autoclavage (vapeur d’eau sous pression) : 20 minutes
à 120°C.

Inoculation = rajouter une petite quantité de bactéries dans le milieu.

Incubation = mettre le milieu inoculé en conditions optimales de températures. Elle dure entre 18 et
24h.

Le milieu de culture peut être liquide (bouillon) ou solide (gélose). Bouillon + agar agar = gélose.

On peut mettre la gélose en tube : c’est quand on s’intéresse à la respiration des bactéries.

Les sels biliaires inhibent les bactéries GRAM+.

Milieu ordinaire (ou minimum) : la plupart des bactéries peu exigeantes peuvent croître. Il s’agit du
bouillon nutritif ou la gélose au soja.

Milieu enrichi : croissance de certaines bactéries sans nuire aux autres. C’est un milieu ordinaire avec
de la matière organique très riche. Il s’agit de la gélose au sang ou au chocolat.

Milieu sélectif : croissance de certaines bactéries au détriment des autres. Seules les bactéries
GRAM- peuvent vivre dans un milieu riche en sels biliaires. Milieux :

- Gélose Hektoen : renferme des sels biliaires et des sucres (lactose, saccharose et salicine). Si
les bactéries GRAM- assimilent au moins un de ces sucres, alors, grâce à des colorants, elles
apparaissent jaunes-orangés : E. Coli par ex. Sinon, elles apparaissent en bleu-vert :
pseudomonas par ex.
- Milieu CHAPMAN (riche en NaCl) : il est sélectif des Staphylocoques.

Le froid conserve les cultures bactériennes. Une température de 4°C conserve des cultures
bactériennes jusqu’à 1 mois. On conserve des cultures pures, pas des mélanges.
Dans un cryotube + solvants + conservateur : on met à -80 ou -180°C. Elles peuvent être conservées
des années.

Lyophilisation : congélateur à -20°C. Se conservent des années. On les réhydrate puis les met dans
des bouillons pour les réveiller.

III / Ensemencement et isolement bactériens

1) Ensemencement par stries

Si la gélose est dans un tube : méthode de beurrage (beaucoup d’inoculum dans la gélose ; stries en
zigzag avec l’oese du bas vers le haut), ou technique d’isolement.

Isolement = obtenir des colonies isolées après incubation. Une colonie isolée est intéressante car
provient d’une cellule seule (les cellules filles sont toutes identiques). On prend 3 tubes, on prélève
un petit inoculum et on ensemence par stries les 3 tubes à la suite. Stries du bas vers le haut.

Méthode des cadrans : on strie la zone 1 (moitié de la boite), puis on flambe l’oese. Pour strier la
zone 2, on recroise les dernières stries. Flamber l’oese. Pour la zone 3, même méthode. On n’ouvre
pas la boite, on l’entre-ouvre juste.

Cette méthode ne suffit pas si l’inoculum de départ est pauvre (peu de bactéries). Il sera vite épuisé.
Dans ce cas, on fait la méthode rayonnante = 1 seule zone. On fatigue le moins possible l’inoculum.
On prélève l’inoculum avec l’oese, puis on fait des stries en repartant toujours du point de départ. On
ne flambe jamais l’oese.
Si l’inoculum est trop riche, on fait la méthode multi-zones. Avec l’oese, on prélève le moins
d’inoculum possible. On flambe à chaque fin de zone. Puis on revient une fois en arrière pour recréer
une zone.

Dans le cas 1, il a flambé l’oese à la fin de la zone, mais n’a pas attendu avant de continuer la
méthode. Il a grillé les bactéries. Il n’est peut-être pas repassé en arrière.

Dans le cas 2, l’oese n’a pas été flambée. Il est trop souvent revenu en arrière. Il n’a pas fait assez de
stries. Il a peut-être retouché la suspension de départ.

2) Ensemencement en nappes

Avec la pipette Pasteur, on pose quelques gouttes (10) de l’inoculum sur la gélose.

On fait des mouvements circulaires à plat sur la paillasse avec la boite de façon à bien répartir
l’inoculum.

IV / Ensemencement bactérien en milieu liquide (bouillon)

On fait un vortex manuel (comme pour faire du feu : frictions).

V/ Observation microscopique de colonies isolées sur gélose

On observe d’abord soit à l’œil nu, soit à la loupe. Plusieurs critères à observer :

- Pigmentation : à l’œil nu, on fait des hypothèses

- Taille des colonies 
- Forme des colonies
- Elévation / relief des colonies (loupe binoculaire) : 5 reliefs différents (plate, convexe,
bombée, ombiliquée, cratériforme)
- Pourtour de la colonie (loupe binoculaire) : 7 termes (régulier, ondulé, lobé, dentelé, crénelé
très rare, filamenteux, rhizoïde)

3 derniers critères : transparent/opaque (vis-à-vis de la gélose ) ; aspect de la surface de la colonie (S

smooth lisse & brillante ; R rough matte & rugueuse ; M mucus grasse & brillante) ; consistance de la
colonie (crémeuse = émulsion homogène ; pulvérulente (poudre) = très sèche & émulsion mauvaise ;
filante ou collante = très bonne émulsion dans l’eau).

Souvent, la colonie R est pulvérulente, et la colonie M est collante.

VI / Examen microscopique des bactéries

Il existe 2 méthodes pour observer les bactéries au microscope : état frais et frottis fixé.

1) Etat frais

On va observer des bactéries vivantes dans une goutte de liquide entre lame et lamelle. Cela
s’observe à grossissement moyen (objectif 40).

Le critère mobilité est très important : on doit voir si les bactéries sont mobiles ou non. Il ne faut pas
confondre la mobilité des bactéries avec un courant liquidien, ni avec un mouvement brownien (lié
aux photons de la lumière au contact de l’eau : les bactéries tremblent).

On doit donner la forme (morphologie) des bactéries et leur mode d’association :

On part d’une lame stérile. On met une toute petite goutte d’eau stérile sur la lame, puis on y ajoute
peu de bactéries (avec l’oese) et on mélange à la goutte. Pour faciliter l’observation, on peut ajouter
de l’éosine (colorant rouge) à côté de la goutte d’eau. Lorsqu’on rajoute la lamelle par-dessus, les 2
gouttes se rejoignent.
On met un minimum de lumière sous le microscope. Beaucoup de photons à la lampe, mais on baisse
le condenseur et on ferme le diaphragme.

On doit observer dans les 10 minutes car l’état frais ne persiste pas longtemps.

2) Frottis fixé

Ce sont des bactéries mortes qu’on observe, sans être dénaturées. On doit les tuer sans les abimer.

Elles vont être étalées et collées sur une lame en verre.

On peut les observer à fort grossissement (objectif 100).

Les critères à observer sont la morphologie (forme) des bactéries avec précision, leur mode
d’association (aucun doute possible) et leur taille (calculer le diamètre du champ optique).

Diamètre du champ optique : I / O ; avec I = indice des oculaires (chiffre après la barre de fraction sur
les oculaires) et O = objectif. Exemple : 18/100 = 0.18mm = 180 um

On pose une goutte d’eau stérile qu’on pose sur la lame. On prélève, à l’aide de la pipette Pasteur, un
peu de suspension homogène (bien mélange). On la pose dans la goutte d’eau. On prend l’oese,
qu’on plonge dans la goutte d’eau sur la lame et on étale les bactéries sur la lame proche du feu (cela
fait sécher l’eau et il ne reste que les empreintes des bactéries).

La fixation tue et colle les bactéries. On règle le bec Bunsen sur la flamme jaune plutôt que bleue,
grâce aux bagues percées de trous en bas. On ferme les trous pour avoir une flamme jaune. On passe
la lame de frottis sec 3 fois à l’intérieur de la flamme jaune. Il faut mettre le côté de la lame qui porte
les bactéries dans la flamme.

On doit colorer avant d’observer. On classe les colorations en fonction du nombre de colorants
utilisées (simple si un seul colorant ; coloration combinée si plusieurs colorants). On peut aussi les
classer en fonction du mode d’action des colorants (agissent directement : coloration directe /
agissent si on rajoute une colle : coloration indirecte).
Exemple de la coloration de GRAM d’un frottis fixé :

On différencie les bactéries par la perméabilité de leur paroi bactérienne à un solvant.

Mordant = colle.

On plonge le frottis fixé dans le cristal violet pendant une minute puis on rince la lame
abondamment. On plonge la lame 1 minute dans le lugol. On rince encore. Dans l’alcool acétone, on
fait un va et vient sans lâcher complètement la lame, pendant max 5 secondes. On rince
abondamment à l’aide d’une grosse pissette comme précédemment. On plonge la lame dans le
colorant rose pendant 1 minute. On rince abondamment et on sèche la lame (on pose du sopalin
dessus). Les bactéries violettes sont GRAM+ et les roses GRAM-.

On observe le résultat de la coloration, la taille, la forme et le mode d’association des bactéries.

On relève le condensateur et on ouvre le diaphragme pour observer la bonne couleur.

GRAM ne marche qu’avec des jeunes bactéries.

L’objectif est de voir si les souches sporulent ou non. On force par la chaleur des enveloppes des
spores bactériennes pour y faire pénétrer un colorant vert.
On réalise un nouveau frottis fixé, qu’on pose sur un portoir chauffant. On ajoute quelques gouttes
de vert malachite, on attend que ça sèche, puis on rajoute quelques gouttes, etc pendant 10 minutes.
On refroidit rapidement la lame avec la pissette, pendant une trentaine de secondes. Puis on plonge
pendant 1 minute dans le colorant rose, puis on rince et on sèche.

On observe avec le condenseur relevé et le diaphragme ouvert. On doit voir des petites tâches
vertes, il n’y a plus de rose si la sporulation est complète. Si le vert est à l’intérieur de bactéries
(qu’on repère grâce à leur cytoplasme rose), la souche sait sporuler (endospores). S’il n’y a que du
rose, la souche ne sporule pas.

Les bactéries GRAM- ne sporulent jamais, seules quelques GRAM+ sporulent.

VII / Identification des souches bactériennes en fonction de leur sensibilité aux antibiotiques

Un antibiogramme permet l’étude de la sensibilité d’une bactérie aux antibiotiques.

CMI = Concentration minimale inhibitrice / CML = Concentration minimale létale

1) Méthode de dilution en milieu liquide

Cela peut se faire en bouillon ou en gélose.

En bouillon, on a toujours le bouillon Mueller Hinton. On met le même inoculum de bactéries pures
dans chaque tube. On y ajoute de l’antibiotique, de façon à ce qu’il soit de plus en plus concentré. On
incube 24h à 37°C.
Le trouble s’éclaircit de plus en plus selon la concentration. Le premier tube complètement
transparent correspond à la CMI.

2) Méthode de dilution en milieu solide

On coule en nappe un antibiotique à la surface de la gélose Mueller Hinton. On rajoute ensuite la

suspension pure bactérienne (goutte). On peut tester plusieurs souches sur une même boite, car il y
a la place. On incube ensuite 24h à 37°C. Voilà le potentiel résultat :
Si les souches ne disparaissent pas, cela signifie qu’elles sont résistantes à l’antibiotique. Si elles
disparaissent, on note la concentration d’antibiotique à laquelle elles sont inhibées (CMI).

3) Méthode de diffusion : antibiogramme standard

On ensemence la gélose Mueller Hinton en nappe par une souche bactérienne pure : une dizaine de
gouttes qu’on étale en tournant la boite. On dépose des disques d’antibiotiques différents à des
concentrations connues (10ug par ex). On met généralement 3 antibiotiques différents sur chaque
boite. On incube ensuite 24h à 37°C.

S’il y a des trous transparents, c’est que l’antibiotique a agi.

On établit une relation avec la CMI et la sensibilité des souches aux antibiotiques, grâce aux
diamètres mesurés. On compare avec les courbes de concordance données par l’OMS.

Entre 16 et 23mm, on ne peut pas se prononcer.

On peut se servir de ces courbes seulement si la méthode de Kirby-Bauer est appliquée : on doit
travailler sur des géloses Mueller-Hinton ; on doit travailler avec des souches bactériennes pures,
jeunes et homogènes ; on incube à 37°C ; on utilise des pastilles d’antibiotiques homologués.
Ce diapo est à imprimer pour les TP.

4) Détermination des concentrations critiques des antibiotiques en bactériologie clinique

Le taux sanguin en antibiotique dépend de la posologie. Quand on se fait prescrire une posologie
usuelle, le taux sanguin moyen obtenu correspond à « c » (concentration critique inférieure). Dans le
cas d’une administration à forte dose, le taux sanguin obtenu maximal correspond à « C »
(concentration critique supérieure).

Une bactérie pathogène sera sensible à un antibiotique quand la CMI de l’antibiotique est inférieure
ou égale à « c ». Elle sera résistante à un antibiotique quand la CMI de l’antibiotique est supérieure à
« C ».

Quand la CMI est comprise entre « c » et « C », on ne sait pas si la bactérie pathogène sera sensible
ou résistante.
 5) Association d’antibiotiques

On effectue des associations d’antibiotiques pour raccourcir le temps de traitement ou éviter une
résistance bactérienne.

Cela peut donner 3 grands types de résultats :

- Synergie entre les 2 antibiotiques bactéricides : l’action totale de l’association est supérieure
à l’action de chaque antibiotique isolé
- Indifférence entre les 2 antibiotiques bactériostatiques : l’action totale de l’association est
égale à l’action de chaque antibiotique isolé. Cela n’a aucun intérêt
- Antagonisme entre 2 antibiotiques bactéricides : l’action totale de l’association est inférieure
à l’action de chaque antibiotique isolé