UNIVERSITE SULTAN MOULAY SLIMANE FACULTE

DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE BENI MELLAL

DEPARTEMENT: SCIENCES DE A VIE

TRAVAUX PRATIQUES DE LA MICROBIOLOGIE GENERALE

BCG-S4 G4 Equ:7

APPRENDRE LES TECHNIQUES DE LA MICROBIOOGIQUE PRATIQUE

Réalisé par : Meriem E BASRIR

Résponsable: Pr. Azeddin EL BARNOSSI

Année universitaire:2023-2024
 SOMMAIRE

I. Introduction
II. Les méthodes et le matériel biologique utilisé dans les quatre TP
III. Résultat
IV. Conclusion
 INTRODUCTION

• Les micro-organismes aussi appelés microbes et protistes, forment un ensemble d’organismes

vivants microscopiques, invisibles à l’œil nu. Les protistes se composent : des bactéries, des
protozoaires, des champignons (mycètes) Microscopique, et des algues. Les virus sont
considérés comme des microorganismes non vivants, acellulaires qui dépendent entièrement
des cellules hôtes infectées.
L’étude in vitro de ces microorganismes nécessite un matériel et appareillage spécifique et un
laboratoire de structure un peu aussi spécial. Les manipulations microbiologiques font
intervenir souvent des microorganismes pathogènes. Donc il est indispensable de se protéger
contre les contaminations tout en respectant les conditions d’asepsie et les consignes de
sécurité.
On trouve dans la biosphère (Air,Sol,Eau) des êtres vivants non visible à l’œil nu , se sont des
micro-organismes (Bactéries, Virus, Algues unicellulaires, Frise)
Les méthodes et le matériel biologique utilisé dans les quatre TP

Présentation d’un poste de travail :

- Matériel (bec bunsen, pipettes, anse de
platine, pince..) en désignant ceux qui sont
récupérables et ceux qui sont jetables (à
utilisation unique) .
Pipettes Pasteur, Lames, Lamelles, Boites
Pétri en plastique, La pince, Tubes à essai, La
loupe,
- Produits (alcool, colorants,…) , (milieux de
culture, alcool, colorants, réactifs…), coton
cardé, cônes, Agar-agar = gélose
 ETUDE DE QUELQUES SOURCES DE CONTAMINATION :

• Pour mise en évidence quelques sources de contamination microbiennes , on a réalisé les manipulations suivante :

situation Sources de contaminations Manipulations

A Mains Partager la boîte de pétri en

deux : sur une moitié : mettre
les empreintes des doigts
sans les laver et sur l’autre
moitié : mettre les
empreintes des doigts lavés à
l’eau de javel
B Cheveux ouvrir la boîte de
pétri ,agiter les cheveux sur la
gélose de façon à faire
tomber des cheveux et des
pellicules sur la gélose
C Voies ouvrir la boîte de pétri ,
tousser et souffler sur la
gélose plusieurs fois , puis
fermer la boîte
D Air laisser la boite ouverte
pendant 15 min loin de bec
Bunsen
 Résultat

• LECTURE DE RÉSULTAT :
A : Analyse d’un échantillon du sol:
10-1 Tapis bactérienne .
10-2 Tapis bactérienne .
10-3 Tapis bactérienne .
10-4 Tapis bactérienne .
10-5 Des colonies jaunes a un plan circulaire et élévation convexe avec un bord régulier, une surface lisse et mate et une opacité
opaque .
10-6 Des colonies isolés jaunes a un plan circulaire et élévation convexe avec un bord régulier, une surface lisse et mate et une
opacité opaque.
Etude de quelques sources de contamination
 ❖COLORATION DE GRAM

• C’est une méthode de coloration qui permet d’identifier et de classifier la structure de la paroi bactérienne.
➔On chauffe l’anse pour sa stériliser , et on la laisse jusqu'à ce que refroidisse avant d’utiliser
➔On utilise l’anse pour prélever une espèce bactérienne
➔Dans une lame propre on met une goutte d’eau puis on met le fragment de la colonie quand on a prélevé avec l’anse .
➔On chauffe la lame jusqu’à la vaporisation de la goutte d’eau et la fixation de l'empreinte bactérienne .
➔Appliquer le cristal violet d’une durée entre 30 sec et 1 min puis rincer (Coloration de contenu de la bactérie)
➔Appliquer le Lugo pendant 1 min (Fixation de coloration interne). ➔Décoloration rapide à l’alcool d’une durée entre 5 à 10
sec .
➔Recoloration à la safranine d’une durée entre 30 sec et 1 min (Coloration du bactérie à Gram - au rose)

Observation Microscopique

Après quand on a appliqué les étapes précédant , notre groupe à observer dans le microscope que notre
échantillon est une bactérie avec Gram négative
 DÉNOMBREMENT SUR MILIEU SOLIDE

• C’est le comptage des cellules bactériennes sur un milieu de culture solide qui permet le dénombrement
bactérien par rapport à un volu
• L’ensemencement et L’incubation On a déjà préparé les dilutions 10-1 jusqu’à 10-3 . On a 9 tubes chacun
contenant 9 ml de milieu de culture liquide, on a numé 3 tubes commençant par 10-1 jusqu’à 10-3 , donc on
a obtenu 3 tubes de 10-1 , trois tubes de 10-2 et trois tubes de 10-3 . Pour cultiver les bactéries qui ont dans
les dilutions , on a pris 1 ml du dilution 10-1 et le verse dans le 1er tube et on a répété cette méthode pour
les autres tubes de 10-1 , sachant qu’on a fait la même chose pour les tubes de 10-2 et 10-3 . Puis on laissé
les 9 tubes dans l’incubateur pendant 5 jours à 30°C .me déterminé:
DÉNOMBREMENT SUR MILIEU LIQUIDE
C’est une estimation statistiques du nombre le plus probable de cellules bactériennes présente dans
un échantillon donné par rapport à un volume déterminé et qui se réalise sur un milieu de culture liquide.

Dilution On six tube à essai chacun contient 9 ml de l’eau physiologie , on met 1 g du sol
dans le 1er tube et l’agité avec le veto , puis on a prélevé 1 ml du dilution 10-1 et on le met
au 2éme tube pour avoir la dilution 10-2 , après on a prend 1 ml du dilution et on le met
dans le 3éme tube pour avoir la dilution 10-3. on a donné à nous camarades la dilution 10-3
pour continuer jusqu'à la dilution 10-6
L’ensemencement et L’incubation Après la préparation des dilutions de 10-1 jusqu’à 10-3
On a prend 3 boites de pétri et coller avec milieux de culture solide et les numé de 10-1
jusqu’à 10-3 , puis on prend 1 ml du dilution 10-1 et le met à la boîte de pétri 10-1 , on
répétant cette méthode jusqu’au 10-3 On met les boîtes de pétri dans l’incubateur pendant 5
jours à 30°C .
 DÉNOMBREMENT SUR MILIEU SOLIDE

Résultat et Interprétation Après la fin de l’incubation on observé les résultats présentés dans le tableau suivant :
10-1 Tapis bactérienne >300 10-2 Tapis bactérienne >300 10-3 Tapis bactérienne >300.

10-4 Tapis bactérienne >300

10-5 Des colonies en jaune avec un plan circulaire, une élévation convexe et plate, une bord régulier avec
une surface lisse mate et une opacité opaque 50.

10-6 Des colonies en jaune avec un plan circulaire, une élévation convexe et plate, une bord régulier avec
une surface lisse mate et une opacité opaque 26.

Interprétation - A cause de la concentration élevée des quartes premières dilutions on ne peut pas
savoir le nombre exact de colonies . - Dans la dilution 10-5 le nombre des colonies est comptable
mais dans la dilution 10-6 le nombre des colonies est inférieur à 30 donc il est très faible. - Basant sur
tout ça on peut dire que nos résultats sont logiques grâce à l’application de la correcte façon de
manipulation .
 CONCLUSION

• Durant les trois séance de ce TP, on a étudié des techniques qui

nous a permet d’analyser les bactéries , on a connaitre
comment manipuler correctement sans laisser notre
échantillon contaminé, en plus de la connaissance la différence
entre l'utilisation de milieu de culture solide et milieu de
culture liquide et les techniques de stérilisation .