TP N° 4 -Contrôle de l’environnement (surface, Air et eaux)

I- Contrôle de surface
Objectifs
-Vérifier la bonne application des procédures de bionettoyage
-Évaluer le niveau microbiologique pour une activité donnée.
Quand prelever?
-Hors présence humaine: après la procédure de bionettoyage (vérification de l’application et
de l’efficacité) avant l’activité!!!
-Tout au long de l’activité: permet d’étudier la recontamination

1.Methode par count tact

-Gélose count tact d’une surface de 25 cm²
-Applicateur : 500g (± 50g) pendant 10 secondes. SURFACES

Analyses :
Incubation des géloses (TSA) à 30°C pendant 5 jours.
Lecture intermédiaire à 3 jours.
Identification systématique des microorganismes isolés

2.Méthode par écouvillonnage

Écouvillons stériles emballés dans un fourreau

-Surfaces : Après humidification à l’aide d’eau stérile, réaliser le prélèvement en quadrillant

une zone d’une surface connue.
D le cas des siphons,
-plonger l’écouvillon dans le siphon, réaliser un mouvement circulaire

. Analyses
Gélose adaptée aux micro-organismes recherchés
• Flore totale : PCA, Columbia au sang
• Fongi : Gélose au malt, Sabouraud.
-Etaler sur gélose appropriée l’écouvillon en quadrillage, et en faisant tourner l’écouvillon.
-Incuber les géloses selon les recommandations du fabricant et des exigences du micro-
organisme recherché.
-Identification.

II- Contrôle de l’air

Objectif :
Mettre en évidence expérimentalement la présence de micro-organismes dans l’air d’un local
et énoncer leurs dangers afin d’en dégager des gestes de prévention à appliquer par le
personnel dans son milieu professionnel visant à limiter le risque de contamination par la flore
de l’air.

I. Expérience
a- Technique :

1) Numéroter à l’aide d’un marqueur 3 boîtes gélosées : N° 1, N° 2, N° 3

2) Placer les boîtes N° 1, 2 et 3 ouvertes dans les conditions suivantes :
- boîte N° 1 à l’extérieur du laboratoire dans un endroit abrité (ex : rebord de fenêtre)
pendant 30 min. au moins,
- boîte N° 2 à l’intérieur du laboratoire dans un endroit calme, sur la paillasse pendant 30
min. au moins,
- boîte N° 3 à l’intérieur du laboratoire, sur la paillasse pendant 30 min. au moins, dans un
endroit agité
(ex. : essuyage à sec de la paillasse, mouvement de personnes ….).

- Incubation des géloses à 30°C pendant 5 jours., lecture intermédiaire à 3 jours.

Définition du terme « incubation de micro-organismes» : temps nécessaire à la

multiplication des micro-organismes (bactéries, moisissures …) sur un milieu nutritif
(gélose).

b- Observation et évaluation des résultats

Examiner les boîtes après incubation et présenter les résultats dans le tableau ci-dessous.

Aspect des colonies

N° de la boîte et Nom des Nombre de colonies bactériennes
conditions opérateurs (de bactéries et de (ex : couleur, taille,
de (groupe de 2 moisissures) translucide ou opaque,
l’expérimentation élèves) bord régulier ou
irrégulier)
et des colonies de
moisissures
(couleur, taille)
Définition d’une colonie de micro-organismes : population de micro-organismes (bactéries,
moisissures …) dérivée d’une cellule unique facilement observable à l’œil nu sur un milieu
nutritif solide (gélose).
(Remarque : quand il y a une seule cellule, elle est microscopique donc invisible à l’œil nu ;
quand le nombre de cellules devient très élevé, celles-ci deviennent macroscopiques donc
visibles à l’œil nu.)

Comment différencier les colonies de bactéries et de moisissures ?

- colonies bactériennes : amas de plusieurs millions de bactéries se présentant sous forme de
petits ronds généralement lisses sur la gélose d’aspect et de couleurs variés (ex : blanche,
crème, jaune, orange …) selon les espèces représentées.
- colonies de moisissures : se présentent en cercles de taille parfois importante ayant un
aspect de velours, cotonneux, poudreux et de couleur bleuâtre, grisâtre ou verdâtre selon les
espèces.

III- Contrôle de l’eau

Objectif
L’examen microbiologique de l’eau est de fournir des informations quant à la présence de
micro-organismes qui causent des maladies, provenant généralement d’une contamination par
des matières fécales humaines ou d’autres animaux à sang chaud.
a- Analyse d’une eau contaminée
a.1- Préparation des dilutions
Avant d’ensemencer les milieux, on effectue des dilutions en cascades de la solution 10-1 à la
solution 10-5 :

On prélève du tube contenant l’eau à analyser 1mL que l’on place dans un des tubes
contenant les 9mL de tryptone-sel, on homogénéise la solution à l’aide du vortex, puis on
prélève 1mL de ce tube pour le mettre dans un troisième tube et ainsi de suite jusqu’au
cinquième tube. (voir schéma ci-dessous)

:
a.2- Analyse
Afin de dénombrer les microorganismes contenus dans l’eau on suit le tableau
Suivant

b- Analyse d’une eau peu contaminée

Certains micro-organismes étant à une concentration très faible dans l’eau, il est logique
d’envisager que par filtration d’un volume important d’eau, on puisse arrêter sur le filtre
toutes les bactéries présentes. Les pores du filtre doivent être, bien sûr, de dimensions
inférieures à celles des bactéries. Une fois les micro-organismes recueillis, toute analyse peut
être faite en reportant le filtre sur un milieu adéquat

Méthode de filtration sur membranes

1. Matériel
L’appareil est un simple système de filtration sous pression réduite (trompe à eau). Il contient
un support filtre qui reçoit, sur une partie à larges pores, la membrane de filtration. Le godet
permet de recevoir l’eau à analyser. Les deus partie doivent s’assembler de manière solide par
aimants, par caoutchoucs. Enfin, l’ensemble doit être stérilisable. Les membranes utilisées (en
ester de cellulose) sont quadrillées, et les pores ont un diamètre de 0.45 μm.

2. Mode opératoire
L’ensemble de l’appareillage doit être placé prés d’un bec benzène, de manière à ménager une
zone de travail stérile, et à pouvoir stériliser le matériel.
- Flamber l’ensemble du système de filtration.
- Flamber une pince à bout plat permettant de saisir les membranes sans les altérer.
- A l’aide de cette pince, on saisi la membrane délicatement que l’on va placer sur le support
de filtre.
- Verse doucement 100mL de l’eau à analyser.
- Faire le vide sans brutalité pour ne pas briser la membrane.
- Rincer, avec de l’eau stérile, l’ensemble de l’appareil, en particuliers les bords internes du
godet.
- Sécher la membrane.
- Débrancher le tuyau à vide avant le fermer le robinet.
- Retirer la membrane, à l’aide de la pince.
- Poser la membrane sur le milieu en la roulant, de manière à ne pas emprisonner de
bulles d'air
- Incuber à la température choisie