TD n°4 : Exercices d’application

Microbiologie Générale: S3 - SVI

FSSM

2021-2022

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 Des bactéries sur milieu de culture Des champignons

Levure

Une cyanobactérie : Synechocystis sp.

2
La levure boulangère
Tableau : Comparaison de la paroi des bactéries à Gram + et à Gram -

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 Coloration de Gram
• Recouvrir le frottis d’une solution de
violet de gentiane ou violet cristallisé.
• Laisser 1 min.
• Egoutter (verser le colorant).
• Recouvrir d’une solution de lugol.
• Laisser 1 min et égoutter.
• Rincer à l’eau du robinet.
• Plonger la lame dans un bain d’alcool et laisser agir 30 secondes en agitant
doucement ;
• Rincer abondamment à l’eau du robinet.
• Couvrir de solution de fuchsine ou de safranine.
• Laisser 30 secondes.
• Rincer à l’eau du robinet.
• Sécher avec du papier buvard et observer.
• Observation microscopique : Objectif x 40 (G: x 400) puis Objectif x
100 (G: x 1000)+ Huile à immersion

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 Coloration de Gram

1 min

1 min
Rinçage
Alcool 30 secondes

Rinçage
30 secondes

Rinçage
Coloration violette rose
Gram + Gram - 5
6
Mélange de bactéries
à Gram + et à Gram -

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FORMES ET REGROUPEMENTS DES BACTÉRIES

1
9
10
11
2- Différents types de dénombrement bactérien :

Méthodes directes :
* Le comptage direct sous microscope des cellules peut se faire à l’aide d’un hématimètre appelé Lame de Thoma
(c’est une lame creuse munie au centre d’un quadrillage d’environ 400 petits carrés de dimension (Surface et Hauteur) bien
déterminée).
Lame de Thoma = Cellule de Malassez = Hématimètre

1 petit carré

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 Dépôt de 0,01 ml

Laisser reposer pendant 30 minutes:

Décantation des cellules

Urine d’un malade

Observation microscopique
au fort grossissement

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Avantage: détermination rapide du nombre de cellules
bactériens

Inconvénient : dénombrement des cellules mortes et

vivantes et dans certains cas les petits débris

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• Epifluorescence : Les bactéries sont colorées par un fluorochrome (Orange d’acridine ou Erythrosine), puis
observées au microscope en lumière UV.

Microscope à épifluorescence Cellules bactériennes colorées en orange observées sous UV

Avantage: Cette méthode permet de compter sélectivement les bactéries vivantes fluorescentes à une couleur
différente des cellules mortes.

Inconvénient : Changement de la couleur des cellules avec le pH du milieu par exemple.

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* Compteur de particules :

Cet appareil réalise automatiquement le dénombrement des particules ou cellules en

suspension dans une solution, grâce aux modifications de résistances électriques qu’elles
provoquent à leur passage à travers un orifice calibré.

Compteur de bactéries
et de cellules somatiques

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Méthodes de dénombrement indirectes

• Le dénombrement se fait après culture bactérienne

Bactéries + éléments nutritifs (C , N, O2 , etc…)

Biomasse cellulaire + Produits

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Méthodes indirectes : (après culture)

Le dénombrement se base sur l’évaluation de cette biomasse soit par :

* Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :

La biomasse peut être évaluée par pesée du poids sec après filtration et séchage ou par mesure de la Densité optique du
trouble (DO au spectrophotomètre).

* Mesure de l’activité des bactéries, en suivant la cinétique de disparition d’un substrat ou celle de l’apparition d’un
produit final.

* Méthode de dilution-étalement : voir Exercices d’application

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Technique de dilutions-étalement

Objectif: détermination du nombre de bactéries dans l’urine d’un malade:

Dilution en série de l’échantillon de l’urine

1 ml

9 ml eau physiologique stérile

=
Urine d’un malade Eau distillée + 9 g/l NaCl

10-1
19
Technique de dilutions-étalement

Dilution en série de l’échantillon de l’urine

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml eau physiologique stérile

=
Urine d’un malade Eau distillée + 9 g/l NaCl

10-1 10-2 10-3 10-4

0,1 ml
Incubation

10-1 10-2 10-3 10-4

20 Trois essais
Différences entre les méthodes directes et indirectes :

Méthodes directes : comptent directement les cellules, leur résultat est rapide, mais peuvent compter aussi bien

les cellules mortes que les cellules vivantes.

Méthodes indirectes : ne comptent que les cellules viables et cultivables dans un milieu de culture ; mais

demandent du temps (minimum 24h).

Selon le but recherché et la précision du dénombrement requise, on choisit l’une ou l’autre des méthodes.

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 Le modèle mathématique de la croissance
La croissance se fait selon une progression
géométrique et peut être modélisée par une
équation mathématique.
Les composantes ou variables de cette équation
sont:
Le N0 = Nombre initial de bactéries compté au
temps t0 (taux d’inoculum)
Bactérie N0 à
t0 N= Nombre final de bactéries après n divisions
après un temps T déterminé
Bactéries N1 à t1 Θ = Chaque division a une durée égale à θ ou
temps de génération= t/n; le temps que dure
chaque division
Bactéries N2 à t2
Bactéries N à tn
µ= Nombre de divisions par unité de temps, c’est le
taux de croissance = n/t donc n= µt
N= 2n N0 donc N= 2 µt N0
N augmente de manière exponentielle et donc on
peut l’exprimer en log pour la linéariser
Log N= µt log 2 + log N0 1
 Les différentes phases de la croissance bactérienne
I. La latence correspond à la synthèse et la mobilisation des enzymes nécessaires pour dégrader le
substrat. µ= 0. Pas de multiplication

II. L’accélération: µ= Augmente. Un début de multiplication, de plus en plus des cellules se divisent.

III. La phase exponentielle de croissance: µ= constant et maximal. La mortalité est nulle toutes les
cellules sont viables et se multiplient.

IV. La décélération: µ= diminue. Epuisement du milieu (diminution de la quantité) et début d’autolyse.

V. La phase stationnaire: µ= 0. Autant de cellules qui meurent que celles qui se multiplient

VI. La phase de déclin ou décroissance : µ= négatif. Accumulation de déchets et de toxines dans le

milieu. Il y a plus de cellules qui meurent que de cellules vivantes

1
Exercice
- Donner le nom des différentes
étapes de la croissance.

- Donner un titre au graphique