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Methodologie de l'Antibiogramme FIN-1

Methodologie de l'Antibiogramme FIN-1

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Published by: Jean Paul N'guessan on Jan 02, 2012
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Réalisation de l’antibiogramme

Dr Nathalie Guessennd
Unité des antibiotiques guessennd@yahoo.fr,

Définition (2)
• antibiogramme = outil validé par un biologiste médical médecin de choisir le bon antibiotique, ou l'association d'antibiotiques permettant de traiter efficacement un patient.

L’ ANTIBIOGRAMME Guérir rapidement

Du prélèvement à l'antibiogramme
• On recueille les bactéries :
o o o o o dans dans dans d dans dans le sang (hémoculture). les urines, l selles, les excréments (animaux), les ll l é t ( i ) les crachats, les lavages broncho-alvéolaires, le liquide céphalo-rachidien,

BUT :
Trouver un traitement efficace pour le malade

• Les bactéries sont mises en culture et ensuite identifiées et s'il est nécessaire de réaliser un antibiogramme (décision du biologiste).

Définition (1)
• Antibiogramme permet de mesurer la capacité d’un antibiotique à inhiber la croissance bactérienne in vivo • Il doit être réalisé selon les méthodes standards

Pour être fiable la méthode doit être standardisée
STANDARDISATION :
- de l'inoculum : quantité de bactéries b é i - de la gélose Mueller-Hinton : Muellercomposition du milieu - de l'épaisseur de la gélose : diffusion de l'antibiotique - de la charge d’antibiotique du disque

La standardisation permet:
∞ un antibiogramme reproductible et fiable d antibiotiques ∞ un choix adéquat d’antibiotiques ∞ un minimum de variation ∞ une bonne lecture ∞ une bonne interprétation

L’antibiogramme repose sur la notion de:

CMI: concentration minimale inhibitrice

Concentration minimale inhibitrice (CMI) De dilution milieu solide mili lid milieu liquide De diffusion E-test®

Différentes méthodes

Concentration Minimale inhibitrice (CMI) CMI= plus faible concentration d’antibiotiques capable d’inhiber in vitro toute culture visible de la souche étudiée pendant une période de temps définie
Elle s’exprime en mg/l ou µg/ml

disques

Antibiogramme

Méthodes (1)
• la méthode par diffusion des disques imprégnés d’antibiotiques et la mesure des diamètres ou méthode de Kirby Bauer est celle recommandée par l’OMS

Méthode de diffusion de disques

Méthode standardisée
Selon le Comité de l’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
(http://www.sfm.asso.fr/nouv/general.php?pa=2)

Principe de l’antibiogramme par diffusion
Disque antibiotique(6mm∅) Charge connue

– Milieu recommandé: Mueller Hinton Epaisseur 4 mm et horizontal et bonne composition – Inoculum des colonies adjacentes mais non confluentes – Pré-diffusion et pré-incubation

Inoculation par étalement en p CMI CMI surface de la gélose
Culture Culture

Gélose Mueller Hinton (4mm)

Zone d’inhibition de la culture

Méthode de diffusion en gélose
Utilise des disques de papier filtre (buvard) sur lesquels un antibiotique a été incorporé, séché et stabilisé inoculation de toute la surface de la gélose les disques sont placés sur la surface de la boîte. les antibiotiques diffusent dans la gélose zone d'inhibition

Gradient de diffusion et zone d’inhibition
Disque d’antibiotique C1 C2 C3 C4 Gradient d’antibiotique décroissant Colonies

Zone d’inhibition de la culture

C1 > C2 > C3 > C4

Diamètre d’inhibition

Démarche méthodologique
Principe de la diffusion d’un antibiotique en milieu gélosé à partir d’un disque
Disque surfaçe fond radiale Diffusion

Standardisation

Démarche de qualité

Milieu Mueller Hinton Composition, épaisseur (4mm), horizontalité Inoculum Choix des antibiotiques Dépôt des disques et incubation lecture et interprétation

en profondeur

Inoculum
Matériel Bactérie vivante: Colonies jeunes en phase exponentielle d croissance (18 à h ti ll de i 24h) sur milieu non sélectif Eau physiologique stérile Anse pour prélever les colonies, densitomètre,

Milieu pour antibiogramme

Matériel et réactifs :
Milieu de culture en fonction des germes Milieu de Mueller Hinton non supplémenté entérobactéries, pseudomonas staphylocoque.

une colonie

2ml eau physiologique : émulsionner les colonies sur le bord du tube ensuite agiter
Ajuster la densité de l’ inoculum à celle de l’étalon 0.5 Mac Farland en y ajoutant soit un fragment de colonie soit de l’eau physiologique

.

Milieu de Mueller Hinton additionné de 5% de sang frais de mouton pour les streptocoques. Gélose chocolat (sang cuit) + sang cuit isovitalex pour Haemophilus et Neisseria.

Ajustement de la turbidité de l’inoculum
Selon la famille de la bactérie : • Enterobacteries et Pseudomonaceae 106 UFC/ml : diluer l’inoculum (0 5 l inoculum (0.5 Mac Farland 108) au 1/100 • Streptococcaceae et Staphylococcaceae:107 UFC : diluer l’inoculum (0.5 Mac Farland) au 1/10.

Souches fragiles
S. pneumoniae
• Neisseriaceae , Haemophilus et

Ensemencement des boîtes
• Ensemencer sur toute la surface de la boîte à 3 reprises Passer enfin l’écouvillon sur le bord de la gélose. g Laisser sécher la boîte pendant quelques minutes à température ambiante, le couvercle étant fermé. Incuber à 35-37°C Staphylococcus et oxacilline: incuber à 30°C

107 UFC : diluer l’inoculum (0.5 Mac Farland) à 1/10: 1000µl dans 10ml

Ensemencement des boîtes E t d b ît

Choix et disposition des disques di

• Inondation préconisée ( CA-SFM)
1ml, tourner et retourner pasteur+poire aspirer avec pipette

Choix et disposition des disques d’ATB
• Choix d’antibiotiques est fait selon le genre de la bactérie (voir : les antibiotiques à tester de chaque espèce CASFM) • La disposition des antibiotiques est faite selon leur classification : β-Lactamines, aminosides, quinolones et fluoroquinolones, macrolides, lincosamides, Permettant ainsi l’interprétation de l’antibiogramme

• Ecouvillonnage (OMS/NCCLS) :
Tremper un écouvillon stérile sec dans l’inoculum éliminer l’excès d’inoculum (en pressant l’écouvillon et en le faisant rouler contre les parois du tube au dessus du niveau du liquide).

LECTURE
• Disposition des disques d’antibiotiques
o Distributeur o Pince Disques à 25mm de centre à centre

• Faire la lecture le lendemain • Mesurer et noter le diamètre de chaque zone d’inhibition en mm d inhibition • Les résultats seront interprétés en fonction des diamètres critiques figurant dans des tableaux d’interprétation

• Lecture des diamètres des zones d’inhibition interprétation

Disposition des disques d’antibiotiques
• Déposer les disques d’ ATB à l’aide d’ une paire de pinces stériles ou d’un distributeur de disques Respecter 25 à 30mm entre les disques Sur une boîte de 90mm, disposer au maximum 7 disques et sur une boîte carrée de 120 x120mm 16 disques

Lecture

OSIRIS®
Automate de lecture

• Appuyer doucement sur chaque disque pour assurer un contact uniforme avec le milieu Laisser diffuser 10 min (prédiffusion). • Mettre les boîtes à incuber à 37°C dans les 30 min qui suivent la préparation pendant 18 à 24 h

diamètre d’inhibition pour chaque atb Ce diamètre correspond à la CMI Ce diamètre est reporté en S, R, I en fonction des f i d diamètres officiels donnés par les comités d’experts

L’ANTIBIOGRAMME
LES RESULTATS

A

B

• Bactérie sensible : S
– La bactérie ne pousse pas en présence de l’antibiotique – Le traitement avec cet antibiotique sera un succès

G

C H

• Bactérie résistante : R
– La bactérie pousse en présence de l’antibiotique – Le traitement avec cet antibiotique sera un échec

F E

D

• Bactérie intermédiaire : I
– Résultat intermédiaire

Réalisation de l’antibiogramme
souche par écouvillonnage Ensemencer Laisser sécher Déposer les disques d’antibiotiques 7/boîte 90 ou 16/boîte 120 Incuber à 37°C 18h à 24h Mesurer les diamètres des zones d’inhibition Interpréter rendu des résultats Par inondation

Les résultats sont rendus au médecin en :

PRINCIPALES CAUSES D’ ERREURS
• Elles sont liées aux : -Inoculum -Disques d’ Di d’antibiotiques ibi i -Milieu de culture -Conditions d’incubation -Lecture et interprétation -Contrôle de qualité

S R I

Sensible Résistant Intermédiaire

Facteurs influençant les résultats
• Facteurs influençant l’antibiotique :
– – – –

la diffusion de

Epaisseur de la gélose : 4 mm Concentration en agar Taille et charge du disque Pré-incubation / Pré-diffusion

Facteurs influençant les résultats
• Facteurs influençant l’activité de l’antibiotique :
– Concentrations ioniques du milieu (Ca2+, Mg2+) – pH du milieu – Concentration de l’inoculum bactérien

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