Vous êtes sur la page 1sur 61

2019-2020

Manuel des Travaux Pratiques


de Bactériologie

Dr. BOUSSENA SABRINA


Institut des Sciences Vétérinaires
Département de Productions Animales
2019-2020
Table des matières
AVANT-PROPOS……………………………………………………………………. 1
TP. N° 1 : LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE…………………………...... 2
1. Types de laboratoires de bactériologie…………………………………... 2
1.1 Niveaux de confinement………………………………………………. 3
1.1.1 Niveau de confinement 1………………………………………… 3
1.1.2 Niveau de confinement 2………………………………………… 3
1.1.3 Niveau de confinement 3………………………………………… 4
1.1.4 Niveau de confinement 4………………………………………… 4
2. Laboratoire de bactériologie médicale de l’ISVK : les différents locaux
de travail et les postes de manipulation)……………………………………. 5
3. Règles à suivre durant les travaux pratiques……………………………. 6
4. Les consignes de sécurité…………………………………………………. 6
5. Consignes de propreté…………………………………………………….. 8
6. Présentation de l’endroit de travail et du matériel………………………. 9
7. Présentation et organisation des postes de manipulation stérile et de
coloration………………………………………………………………………. 9
7.1 Organisation de poste de manipulation stérile…………………….. 9
7.1 Organisation de poste de coloration………….…………………….. 10
8. Ensemencement et mise en culture des bactéries……………………… 11
9. Préparation et utilisation des milieux de culture………………………… 12
9.1 Préparation des milieux en poudre…………………………………... 13
9.2 Types de milieux de culture……………………................................ 13
9.2.1 Milieu sélectif……………………………………………………… 13
9.2.2 Milieu électif……………………………………………………….. 14
9.2.3 Milieu ordinaire……………………………………………………. 14
9.2.4 Milieu enrichi………………………………………………………. 14
10. La stérilisation……………………………………………………………... 15
10.1 Chaleur sèche………………………………………………………… 15
10.2 Chaleur humide………………………………………………………. 15
10.3 Autres procédés de stérilisation…………………………………….. 16
TP. N° 2 : LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE :
I. Premières étapes du diagnostic bactériologique (étude des caractères
morphologiques et culturaux)………………………………………………………. 17
1. Etude des caractères culturaux…………………………………………… 17
2. Etude des caractères morphologiques…………………………………… 19
2.1. Etat frais………………………………………………………………... 19
2.1.1 Mode opératoire…………………………………………………... 19
2.1.2 Observation au microscope……………………………………… 20
2.2 Techniques de coloration simple : bleu de méthylène……………... 20
2.2.1 Technique…………………………………………………………. 20
2.2.2 Observation……………………………………………………….. 20
2.3 Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram………... 20
2.3.1 Technique…………………………………………………………. 21
2.3.2 Observation……………………………………………………….. 21
TP. N° 3: LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE (suite)°:
II. Etude des caractères biochimiques…………………………………………….. 22
1. Préparation de la suspension bactérienne………………………………. 22
2. Recherche de l’enzyme respiratoire……………………………………… 23
2.1 Test de catalase………………………………………………………... 24
2.2 Test d’oxydase…………………………………………………………. 24
2.3 Nitrate réductase……………………………………………………….. 25
3. Quelques milieux d’identification de galerie classique.………………… 28
3.1 Milieux pour l’étude des métabolismes protéique, glucidique et
énergétique………………………………………………………………….. 28
3.1.1 Production d’uréase (métabolisme protéique)………………… 28
3.1.2 Milieu Kligler Hajna……………………………………………….. 29
3.1.3 Milieu Clark et Lubs………………………………………………. 31
3.1.3.1. Test RM (rouge de méthyle)…………………………… 31
3.1.3.2. Test VP (Vosges-Proskauer)………………………….. 31
3.1.4 Citrate de Simmons………………………………………………. 32
3.1.5 Mannitol-Mobilité………………………………………………….. 33
4. Galeries de tests biochimiques miniaturisés (galerie Api)……………… 34
4.1 Choix de la galerie……………………………………………………... 35
4.2 Mode opératoire………………………………………………………... 36
4.3 Lecture et interprétation des résultats……………………………….. 38
TP. N° 4: ANTIBIOGRAMME………………………………………………………. 41
1. Définition…………………………………………………………………….. 41
1.1 Limites de l’antibiogramme……………………………………………. 42
2. Antibiogramme par dilution………………………………………………… 42
2.1 Choix du milieu…………………………………………………………. 42
2.2 Préparation de l’inoculum……………………………………………... 43
3. Antibiogramme par diffusion………………………………………………. 44
3.1 Préparation de l’inoculum……………………………………………... 45
3.2 Choix des disques d’antibiotiques……………………………………. 46
3.3 Choix du milieu…………………………………………………………. 47
3.4 Mode opératoire………………………………………………………... 48
3.4.1 Ensemencement par écouvillonnage…………………………... 48
3.4.2 Ensemencement par inondation………………………………… 48
3.4.3 Application des disques………………………………………….. 49
3.5 Lecture et interprétation……………………………………………….. 50
4. E-test…………………………………………………………………………. 54
5. Association d’antibiotiques………………………………………………… 55
REFERENCES ……………………………………………………………………… 56
Manuel des Travaux Pratiques ___________________________________________ Dr. BOUSSENA

AVANT-PROPOS
Le présent manuel constitue un recueil des travaux pratiques de bactériologie
destiné non seulement aux étudiants préparant leur diplôme de docteur vétérinaire
mais aussi aux enseignants de l’Institut des Sciences Vétérinaires. Afin de s’assurer
que les membres de l’équipe de bactériologie conservent, complètent et améliorent
leurs compétences et ont accès à des outils appropriés pour les guider lors des
travaux pratiques, nous avons soigneusement mis en place ce document avec
l’essentiel des connaissances et des techniques requises en bactériologie.
Concernant la formation des étudiants vétérinaire, ce manuel vise aussi à apporter,
les connaissances sur un ensemble de pratiques réalisées dans le laboratoire afin
d’identifier les bactéries pathogènes issues de divers prélèvements provenant
d’animaux de compagnie ou de rente.
Ainsi, quatre séries de travaux pratiques ont été établies avec toute la rigueur
nécessaire ainsi que l’adaptabilité exigée par les circonstances (laboratoire
pédagogique) et les disponibilités (milieux de cultures et réactifs) du laboratoire de
bactériologie médicale de l’Institut des Sciences Vétérinaires.
Un premier TP intitulé "Laboratoire de bactériologie " traite les consignes de sécurité,
l’organisation et les équipements ainsi que les principales manipulations de base
exercées au niveau du laboratoire de bactériologie médicale. Il est à noter que les
différentes parties abordées dans cette section ont été présentées tout en accordant
une importance particulière à la protection du manipulateur sans compromettre la
qualité des résultats. Un deuxième et un troisième TP réunirent les renseignements
relatifs aux étapes du diagnostic bactériologique et les critères à étudier afin
d’identifier des bactéries pathogènes en particulier d’intérêt vétérinaire préalablement
isoler au sein du laboratoire. Dans un dernier et quatrième TP, l’étude de la
sensibilité des bactéries aux antibiotiques (réalisation de l’antibiogramme, lecture et
interprétation des résultats) a été présentée d’une manière traduisant l’importance de
ce test dans la pratique vétérinaire.
Enfin, il s’avère judicieux de préciser que les renseignements contenus dans le
présent document ne sont pas exhaustifs ; elles feront l’objet de révisions, et toute
suggestion susceptible d’améliorer le contenu sera accueillie avec grand intérêt.

1
Manuel des Travaux Pratiques ___________________________________________ Dr. BOUSSENA

TP. N° 1. LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE : Structure, organisation et


manipulation

Objectifs : familiariser les étudiants avec un laboratoire de bactériologie médicale,


son équipement et son fonctionnement.
Le laboratoire de bactériologie médicale vétérinaire réalise l’étude bactériologique
des prélèvements provenant d’animaux infectés. Ce qui permet :
- De confirmer le diagnostic d’infection.
- De déterminer quelle est l’espèce ou les espèces bactériennes responsables
de cette infection.
- De déterminer à quels antibiotiques ces bactéries sont sensibles c’est-à-dire
avec quels antibiotiques il faudra traiter l’animal pour le guérir de son infection.

1. Types de laboratoires de bactériologie


Les laboratoires de bactériologie (ou encore de microbiologie ou de biologie) sont
principalement orientés vers la manipulation d’agents biologiques pathogènes ou
non. Les manipulations sont réalisées dans des laboratoires dits de confinement (1-
4) pour les substances pathogènes (cf. niveaux de confinement).
En bactériologie courante, les techniques mises en œuvre peuvent avoir divers buts.
En bactériologie médicale, le but est d’effectuer l’isolement et l’identification des
bactéries pathogènes à travers :
- l’examen microscopique : lecture au microscope optique de lames (mise au point)
d’état frais et de colorations (Bleu de méthylène, Gram).
- l’isolement sur milieux de culture bactérienne.
- la reconnaissance des caractéristiques d’une culture bactérienne (caractères
culturaux).
- la reconnaissance des caractéristiques biochimiques d’une culture bactérienne.

En plus, la lecture et l’interprétation des résultats des tests de sensibilité aux


antibiotiques (antibiogramme) sont couramment réalisées au sein du laboratoire de
bactériologie médicale.

En bactériologie alimentaire, l’évaluation quantitative et qualitative d’une éventuelle


pollution et même dans des conditions particulières, la mise en évidence de bactéries
potentiellement pathogène sont les principaux objectifs recherchés.

2
Le contrôle de qualité (contrôle de stérilité, contrôle de qualité de substances
inhibant (antibiotiques par ex.) ou favorisant la croissance bactérienne fait également
partie des missions des laboratoires de bactériologie.

1.1 Niveaux de confinement


Selon le risque issu des bactéries isolées, il existe 4 niveaux de sécurité biologiques
(confinement) :

1.1.1 Niveau de confinement 1


Ce niveau de confinement concerne le laboratoire de base pour la manipulation des
agents du groupe de risque 1 (aucune conception spéciale, pas d’enceintes de
sécurité biologique (hotte à flux laminaire).
Agents du groupe de risque 1 : Agents biologiques peu susceptibles d’infecter une
personne saine ou un animal sain. Ils présentent un risque faible pour l’utilisateur et
la collectivité.

1.1.2 Niveau de confinement 2


Ce niveau de confinement est adapté à la manipulation des agents du groupe de
risque 2. Les principaux risques d’exposition liés à des organismes devant être
manipulés en niveau de confinement 2 sont l’ingestion, l’inoculation et l’exposition de
membranes muqueuses.
Les agents pathogènes traités dans un niveau de confinement 2 ne sont
généralement pas transmissibles par voie aérienne, mais il est important d’éviter la
production d’éclaboussures et d’aérosols qui peuvent se projeter dans l’air
(manipulation dans des enceintes de sécurité biologique, port des équipements de
protection personnels appropriés tels que les gants, les lunettes, etc…).
Agents du groupe de risque 2 : Agents pathogènes susceptibles de provoquer une
maladie chez l’homme et l’animale, mais qui constitue exceptionnellement, un danger
grave pour le personnel du laboratoire, pour la collectivité, pour le bétail ou pour
l’environnement. L’exposition en laboratoire provoque exceptionnellement des
infections graves. Néanmoins, il existe des mesures préventives et thérapeutiques
efficaces, et le risque de propagation de l’agent pathogène est limité. Les risques
sont considérés comme modérés pour les utilisateurs mais faible pour la collectivité.

3
1.1.3 Niveau de confinement 3
Ce niveau de confinement permet la manipulation des agents du groupe de risque 3.
Les agents pathogènes étudiés en niveau de confinement 3 sont transmissibles par
voie aérienne même à faible dose infectieuse, qui est susceptible de provoquer des
maladies graves, voire mortelles. Des barrières primaires et secondaires
additionnelles sont nécessaires pour limiter la libération d’organismes infectieux dans
le laboratoire et dans l’environnement. Il est par conséquence exigé une protection
respiratoire appropriée, des filtres spéciaux pour traiter l’air évacué du laboratoire et
un accès strictement contrôlé au laboratoire pour la prévention de la transmission de
tels organismes.
Agents du groupe de risque 3 : Agents pathogènes responsables généralement
d’une maladie humaine grave ou présentant de lourdes conséquences économiques,
mais qui se transmet exceptionnellement par simple contact de personne à personne
et qui cause rarement des maladies ne pouvant pas être traitées par des agents
antimicrobiens ou antiparasitaires. Les risques sont importants pour les
manipulateurs mais faibles pour la collectivité.

1.1.4 Niveau de confinement 4


C’est le niveau de confinement extrême. Il autorise la manipulation d’agents
transmissibles par aérosol avec une faible dose infectieuse et entraînant des graves
maladies souvent mortelles, pour lesquelles en général il n’existe pas de traitement
ou de vaccin disponible. Le périmètre du laboratoire sera scellé afin d’isoler
complètement l’agent infectieux (port de combinaison d’isolement de l’agent
pathogène) ou bien l’agent sera maintenu dans une enceinte de sécurité biologique
de niveau 3. L’air et les autres effluents produits en laboratoire doivent être
décontaminés.

Agents du groupe de risque 4 : agents pathogènes entraînant généralement de très


grave maladie humaine, souvent impossible à traiter, facilement transmissible par
simple contact par les voies direct ou indirect, de personne à personne ou d’un
animal à une personne et vice-versa. Les risques sont élevés pour les manipulateurs
et pour la collectivité.

4
2. Laboratoire de bactériologie médicale de l’ISVK : les différents locaux de
travail et les postes de manipulation
Le laboratoire de bactériologie de l’Institut des Sciences Vétérinaires d’El Khroub
(ISVK) est en charge des travaux pratiques en bactériologie médicale et des
cliniques des maladies infectieuses. Son activité de conseil s’étend du prélèvement
des échantillons jusqu’à l’interprétation finale des résultats.
Au niveau de son bureau d’accueil, le laboratoire reçoit des prélèvements apportés
par les étudiants vétérinaires, les vétérinaires praticiens, les éleveurs et les
propriétaires des animaux de compagnies. Ces prélèvements utilisés comme
produits pathologiques servent comme outils pédagogique pour la formation des
étudiants lors des travaux pratiques et des cliniques.
Les échantillons présentant un danger biologique sont orientés vers d’autres
laboratoires (zone de tri). Les échantillons ainsi acceptés sont alors identifiés par des
codes enregistrés qui les suivront tout au long de leur parcours dans le laboratoire.
En fonction des examens demandés, les échantillons peuvent être analysés par
colorations et observations microscopiques ou être mis en culture afin d’isoler et
d’identifier par la suite les bactéries pathogènes en cause. Des tests
d’antibiogramme sont éventuellement réalisés pour l’optimisation de l’antibiothérapie.
Les résultats de ces analyses sont ensuite enregistrés manuellement dans un
registre de laboratoire ou informatiquement. Les étudiants sous la supervision des
enseignants participent aux différentes taches de manipulations effectuées lors du
diagnostic bactériologiques (microscopie, culture, identification biochimique, et tests
de sensibilité aux antibiotiques).
Le laboratoire de bactériologie médicale de l’Institut des Sciences Vétérinaires d’El
Khroub dispose aussi de 4 principales pièces techniques (compartiments) distinctes
et suffisamment séparées, réservées exclusivement aux analyses de bactériologie ;
- la première pièce est réservée aux manipulations stériles, les colorations, les
observations microscopiques, l’incubation et la conservation des produits
pathologiques,
- le second compartiment (deuxième pièce) est réservé à la préparation des milieux
de culture, d’identification et de conservation …,
- le troisième compartiment est consacré à l’autoclavage et la stérilisation des
déchets des manipulations.

5
Cette conception a été adoptée afin de respecter l’évolution du travail dans le temps
et surtout de réaliser les travaux pratiques dans des conditions d’hygiène et de
sécurité. Il est à noter qu’une dernière pièce (quatrième) semblable à la première
dédiée aux manipulations stériles a été conçue afin de permettre à plusieurs
personnes de manipuler au même temps.
Le laboratoire est munit de deux accès afin de limiter le croisement des flux.

3. Règles à suivre durant les travaux pratiques


Quels que soient le but recherché et en conséquence, les méthodes à appliquer
dans le laboratoire de bactériologie (médicale et alimentaire), le bactériologiste doit
impérativement respecter certaines règles essentielles :
- éviter d’être contaminé par le produit pathologique manipulé : cette règle
importante doit toujours être respectée quelles que soient les bactéries en question.
- éviter de contaminer le produit pathologique manipulé : La contamination d'un
poste de travail et par conséquence du produit pathologique risque de compromettre
le résultat du diagnostic.
Pour répondre à ces règles impérieuses, le bactériologiste doit s'astreindre au
respect de gestes précis de travail que certains auteurs ont qualifiés de «gestes
rituels de la bactériologie » et d'autres, de réflexes conditionnés.

4. Les consignes de sécurité


- Porter une blouse blanche fermée et manches longue.
- Interdiction formelle de boire, manger, de fumer, de mâcher du chewing-gum…
pendant les TP ou de sortir de la salle de TP sans motif valable.
- Cheveux longs attachés (flamme…) et les ongles courts.

- Ne pas manipuler les téléphones portables pendant les TP.


- Ne porter aucun bijou aux poignets et surtout aux doigts.
- Attention à l’alcool + flamme et des autres produits inflammables.
- Eviter le contact des réactifs de Gram avec la peau.
- Procéder à un lavage minutieux des mains, avec brossage des ongles avant et
après les manipulations, et avant toute sortie même momentanée de la salle de
TP.
- Éviter les ouvertures des fenêtres, de portes pendant les manipulations.

6
- L’étudiant(e) doit éviter de se déplacer en cours de travail, il doit travailler
assis(e), sans geste brusque.
- Ouvrir avec précaution dans la zone de stérilité d’un bec bunsen [un espace
restreint délimité par un rayon de 10cm autour de la flamme d’un bec Bunsen
réglé en intensité moyenne (flamme bleu) (cf. Fig. 1)] les récipients contenant des
cultures microbiennes, afin d'éviter toute projection.
- Les tubes ou les flacons ne sont jamais tenus verticalement mais obliquement,
leur ouverture dirigée vers la flamme.
Les pipettes, pipettes Pasteur ou pipettes graduées doivent être maintenues en
position oblique, leurs pointes dirigées vers le bas.
- D’une façon générale et pour un manipulateur droitier, la main droite, qui
maintient dans la zone aseptique l’anse de platine ou la pipette Pasteur, ne doit
pas se déplacer (coude de la main droite sur la paillasse). Tout le matériel
nécessaire : tubes de milieux de cultures, tubes de liquide de dilutions, tubes
stériles ou lames, doit être porté par la main gauche vers la main droite (cf. Fig. 2).
- Flamber, avant et après manipulations, l’anse de platine utilisée pour les
prélèvements, en commençant par chauffer la partie moyenne de l'instrument afin
de dessécher les restes de culture avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci
pour éviter toute projection.
- Prévenir immédiatement le responsable de TP en cas de bris d'un récipient
contenant une culture, en cas de contamination accidentelle d'un manipulateur ou
tout incident dispersant le matériel microbien.
- Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation.
- Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise à l'abri des souches
microbiennes ainsi que leur destruction afin d'éviter toute contamination.
- Vérification avec l’enseignant avant de quitter la salle des robinets d’eau et de
gaz.

7
Flamme bleu

Fig. 1 : Rôles du bec bunsen.

Fig. 2 : La manière de saisir l’anse de platine et le tube de suspension


bactérienne.

5. Consignes de propreté
 Nettoyer les paillasses avec l’eau de Javel à l’aide d’un torchon.
 Nettoyer les éviers des colorants et remplir les pissettes d’eau et d’alcool.
 Ramener tout le matériel sur les paillasses et ranger le matériel utilisé.
 Jeter le verre et le matériel souillé (tubes à usage unique, lames…) dans le bac
d’eau de Javel.
 Nettoyer les objectifs du papier joseph et de l’alcool iso-amylique et couvrir les
microscopes et la loupe.

8
 Déposer les tubes et les boites de culture ensemencés dans l’étuve ou le
réfrigérateur.
 Lavage minutieux des mains.

6. Présentation de l’endroit de travail et du matériel


Toutes les manipulations sont réalisées sur la paillasse. Elle doit mesurer au
minimum 60 cm (90 cm) de largeur sur 1,5 m de longueur. Elle doit être recouverte
d'un matériau de préférence de couleur blanche, lisse, incombustible, résistant aux
antiseptiques, aux acides, aux bases et aux colorants (marbre par ex.). Toute la salle
doit être bien éclairée (les reflets gênants et les lumières éblouissantes sont à éviter)
de façon à éviter les ombres portées sur la paillasse. Les revêtements de sol doivent
êtres antidérapants.

En plus de l’ameublement, du matériel informatique et de la verrerie, le laboratoire


est équipé du matériel suivant :
- petit matériel : bec bunsen, anse de platine, pipettes Pasteur, micropipettes,
pinces, lames, ...).
- matériel d’optique : microscopes et loupes binoculaires.
- matériel d’incubation et de conservation : incubateurs (étuves), réfrigérateur et
congélateur.
- matériel de stérilisation et de décontamination : hotte à flux laminaire,
autoclaves, stérilisateurs et centrifugeuses.
- matériel de préparation de milieux de culture ou autre (d’identification, de
transport et de conservation) : agitateurs, balance à précision, bains Marie,
distillateur.

7. Présentation et organisation des postes de manipulation stérile et de


coloration

7.1 Organisation de poste de manipulation stérile


Le poste de manipulation stérile est organisé de la façon suivante :
Le bec bunsen permettant d’assurer les conditions de stérilité locale
indispensables à la manipulation stérile, est placé au centre du poste de travail de 15
à 30cm du bord de la paillasse de sorte à ce que le manipulateur soit à l’aise dans sa
9
manipulation. A droite du bec bunsen se trouvent les instruments nécessaires au
travail pour un manipulateur droitier (pipettes Pasteur entreposées dans un récipient
à large ouverture, anse de platine et les pinces disposés sur un portoir). Le reste du
matériel est placé à gauche du bec bunsen (le produit pathologique à étudier, les
boites de Petri placées couvercle en bas, l’eau physiologique stérile…). Derrière le
bec bunsen et légèrement à droite, un récipient en matière plastique rempli d’une
solution antiseptique (eau de javel par exemple) dans lequel seront déposées les
pipettes Pasteur utilisées, les écouvillons et les tube à usage unique. Un gauche n’a
qu’inverser les positions (cf. Fig. 3).

Fig. 3 : Organisation du poste de manipulation stérile.

Le travail est réalisé en position assise ce qui nécessite que tout le matériel soit
disposé à portée de main. L’étudiant doit prévoir tout le matériel nécessaire avant de
commencer la manipulation (tout le matériel doit être accessible sans que l’étudiant
ait à se déplacer ou à être aider par ces collègues). II doit pouvoir manipuler sans
que rien ne s'interpose entre lui et la flamme.

7.2 Organisation de poste de coloration


Quant au poste de coloration, il doit comprendre un bac à coloration surmonté
d’un porte-lame (surmonté lui-même d’une pince pour saisir les lames) et tout autour
de ce bac, une batterie de colorants, de mordant, des pissettes d’eau distillée et
d’alcool sont placés par ordre d’utilisation. De préférence le poste de coloration doit
être installé près du lavabo pour pouvoir effectuer le rinçage surtout s’il y a plusieurs
lames à colorer.

10
8. Ensemencement et mise en culture des bactéries
L’ensemencement est le transport des bactéries dans un milieu de culture neuf et
doit obligatoirement être fait dans des conditions d’asepsie totale. Les cultures sont
faites en milieux liquides (enrichissement) ou en milieux solides (isolement).
Lors d’un diagnostic bactériologique, la mise en culture est toujours nécessaire. Si le
prélèvement provient d’une cavité ouverte et contient par conséquence plusieurs
espèces bactériennes, l’ensemencement sur milieu solide afin d’isoler les bactéries
pathogènes s’avère indispensable. D’ailleurs, c’est à partir de cultures que les divers
caractères biochimiques peuvent être déterminés permettant ainsi l’identification de
ces bactéries.
Sur milieux de culture coulés en tubes, l’ensemencement peut se faire en stries
transversales sur les milieux solidifiés inclinés (stries parallèles et serrées sur la
gélose en pente sans l’érailler) ou en strie médiane (piqure centrale) lorsqu’il s’agit
des milieux en culot (ensemencement en piqûre par le fil en platine ou par une
pipette Pasteur à bout fermé).

Sur milieux de culture solides coulés en boites de Petri, plusieurs techniques


d’ensemencement peuvent être proposées : (cf. Fig. 4 et 5)

Fig. 4 : Etapes de l’ensemencement selon la technique d’isolement.


1. Prélever à l’aide de l’anse de platine une fraction de l’inoculum.
2. Ensemencer par stries fines et très serrées le premier demi-cercle.
3. Flamber l’anse de platine, laisser refroidir.
4. Ensemencer le deuxième demi-cercle.
5. Flamber l’anse de platine.
6. Ensemencer le troisième demi-cercle.

11
Fig. 5 : Ensemencement selon la technique des 4 séries de stries.
1. Tracer sur le fond extérieur de la boite de petri deux diamètres
perpendiculaires séparant la boite en quatre secteurs.
2. Prélever à l'anse (stérile) la suspension ou le bouillon dans le cône
stérile.
3. Avec la main gauche saisir la boite (couvercle sur la paillasse) dans le
cône stérile et déposer l’inoculum sur la surface de la gélose, étaler ensuite le
prélèvement par stries très serrées dans une moitié de quadrant (quadrants 1et
2), flamber l'anse et laisser refroidir.
4. Etaler à nouveau le prélèvement par stries moins serrées dans la moitié
correspondante aux quadrants 2 et 3, flamber l'anse et laisser refroidir.
5. Répéter une dernière fois l'étalement en stries encore moins serrées dans
la moitié correspondante aux quadrants 3 et 4.

Les milieux ainsi ensemencés sont transférés à l’incubateur (étuve). La durée,


l’atmosphère et les températures d’incubation doivent être respectés avec précision.
La vérification de la température des incubateurs doit être un geste journalier et
habituel au bactériologiste.

9. Préparation et utilisation des milieux de culture


- Les micro-organismes exigent pour leur croissance des aliments. Ces aliments leur
sont fournis au laboratoire par des milieux nutritifs ou milieux de culture. Comme les
besoins nutritionnels des microorganismes et les conditions de leurs développements
sont très variés, il n'existe évidemment aucun milieu universel sur lequel tous les
microbes soient capables de se multiplier.

12
- Toutefois, certains milieux conviennent au développement d'une grande variété de
germes microbiens; le choix de tels milieux repose sur la connaissance de l'habitat
naturel et de la physiologie alimentaire du groupe de germes que l'on désire cultiver.

- D'une manière très générale, on peut distinguer :


Les milieux sont soit liquides, soit solides. Les milieux solides présentent un grand
intérêt et permettent, lorsque la technique d'ensemencement est convenable, le
développement des germes en colonies apparentes, isolées les unes des autres,
provenant en principe, de la multiplication d'une seule bactérie (clone) et à partir
desquelles peuvent être obtenues des cultures pures.

9.1 Préparation des milieux en poudre


Matériels : distillateur, béchers, éprouvette graduée, thermomètre, agitateur
magnétique, balance à précision, autoclave, bec bunsen, boites de Petri, des tubes à
vis ou cotonnés stériles, pince en bois ou gants.
Mode opératoire :
- Peser la masse nécessaire de poudre pour un volume (ml) d'eau distillée.
- Dissoudre la poudre dans le diluant à l'aide de l'agitateur magnétique et chauffer
jusqu'à l'ébullition.
- Laisser refroidir la préparation dans le cône stérile du bec bunsen.
- Lorsque la préparation a atteint une température inférieure à 60°C, verser dans des
flacons et stériliser à l’autoclave (sauf indication) à 120°C pendant 20 min.
- Lorsque la préparation a atteint de nouveau une température inférieure à 60°C,
coulé dans des boites de Petri ou des tubes à vis stériles.
- Après refroidissement et pour éviter que l’eau de condensation dans les boîtes de
Petri perturbe la surface du milieu gélosé, on place les boîtes en position retournée.

9.2 Types de milieux de culture


9.2.1 Milieu sélectif
Un milieu de culture est dit sélectif pour une espèce microbienne lorsque seules les
exigences nutritives et les conditions de développement spécifiques de cette espèce
sont satisfaites. En modifiant différents facteurs, il est donc possible d’orienter un
milieu pour que la croissance d’une espèce de bactérie soit favorisée et que les
autres voient leur développement entravée voir inhibée.

13
L’effet sélectif est obtenu en jouant sur les facteurs physico-chimiques (tels que
pression osmotique, pH, …) ou par l’action bactériostatique ou bactéricide de
certaines substances telles que : sels minéraux (azide de sodium, tellurite de sodium,
…) ; substances organiques (eau peptonée phéniquée) ; ou des substances
colorantes (vert brillant, vert malachite, cristal violet, …).
Ils sont utilisés pour isoler les germes de produits poly-microbiens. La nature des
inhibiteurs est variable, il peut s'agir :
- de NaCl : milieu de Chapman à 75‰ pour Staphylococcus, bouillon hypersalé à
65‰ pour Enterococcus.
- de sels biliaires (désoxycholate) : Mac Conkey, Hektoen pour Enterobacteriaceae.
- d'antibiotiques: gélose au sang + ANC (acide nalidixique, colistine) pour les
Streptococcus.
- d'antiseptiques : gélose au cétrimide pour Pseudomonas.

9.2.2 Milieu électif


Un milieu électif est un milieu sur lequel apparait une culture abondante et rapide de
certaines bactéries, alors que la plupart des espèces bactériennes s’y développent
peu et lentement.

9.2.3 Milieu ordinaire


Un milieu ordinaire est un milieu comportant les éléments chimiques strictement
nécessaires à la croissance bactérienne, sous une forme utilisable par des bactéries
n'ayant pas d'exigence nutritive particulière (bactéries non exigeantes).
La composition de ces milieux est simple et sans effet de sélection. Un exemple de
milieu ordinaire pourrait être la gélose nutritive.

9.2.4 Milieu enrichi


Il contient, outre les composants de base, des composants indispensables aux
bactéries, que celles-ci ne peuvent pas synthétiser. C’est un milieu utilisé pour
l'obtention des bactéries dites exigeantes. Par exemple : les milieux au sang frais (le
sang est riche en nutriments divers). Les milieux avec du sérum, du jaune d'œuf.

14
10. La stérilisation
- La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un
objet, et ce de manière durable.
- En bactériologie, le but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-
organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la
contamination du milieu extérieur et des personnes.
- Il existe deux grands moyens de stérilisation : 1. La chaleur 2. La filtration.
Concernant la stérilisation par la chaleur : la chaleur détruit les bactéries et les
spores. On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».

10.1 Chaleur sèche


a). Flambage : c’est le passage dans la flamme (bec Bunsen) de la surface de
matériel non inflammable assure une parfaite stérilisation. On stérilise de cette façon
les fils de platine et les pipettes Pasteur.
b). Four pasteur ou stérilisateur: C'est un four-étuve à air chaud et sec. Il est utilisé à
180°C pendant 90 minutes. Cet appareil n'est utilisé que pour la stérilisation de la
verrerie préalablement nettoyée et séchée ou de matériels métalliques (instruments
de dissection, …) pouvant tolérer de très hautes températures.
Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans le stérillisateur jusqu’à son refroidissement
complet, puis stocké à l’abri des poussières.

10.2 Chaleur humide


La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois modalités : la stérilisation à
l’autoclave, la pasteurisation et la tyndallisation.
a). Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un laboratoire de microbiologie.
Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une température de 120°C
pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du
volume des récipients. Ce procédé tue toutes les cellules végétatives et les
endospores.
b). Pasteurisation : la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides, tuant des
pathogènes mais pas forcément toutes les bactéries. Les températures de la
pasteurisation se situent entre 75 à 80°C.

15
c). Tyndallisation : La tyndallisation est une série de 3 chauffages brefs à des
températures de 70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes
résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant.

10.3 Autres procédés de stérilisation


Certaines matières (plastiques, caoutchous …) ne tolèrent pas l’autoclave ou se
détériorent rapidement après des expositions répétées à la chaleur.
a). Radiations : La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la
décontamination de l’air et des paillasses situées sous la hotte de protection (hotte à
flux laminaire). Le rayonnement n’agit que de façon directe et sa pénétration est
faible. D’autres radiations (rayons X), peuvent servir pour la stérilisation industrielle
des boites de Petri en matière plastique et de produit pharmaceutiques.
b). Agents chimiques : Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles de
travail et pour la destruction des germes portés par des instruments souillés. Ce
mode de stérilisation doit être systématiquement pratiqué dans le laboratoire pour les
lames et pour la verrerie qui ne passe pas en autoclave.

16
TP. N° 2. LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE
I. Premières étapes du diagnostic bactériologique (étude des caractères
morphologiques et culturaux)

Objectifs : Mise en évidence des bactéries à partir de prélèvements (Isolement et


purification) par l’étude des caractères culturaux et morphologiques.
Il faut au préalable faire :
- L’isolement et la purification des souches sur des milieux sélectifs (utiliser une
souche de staphylocoques et une autre d’entérobactéries).
Après 24h d’incubation, les cultures sont purifiées. La sélection est basée sur
l’aspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le diamètre, l’aspect…
- Conservation des souches
Afin de pouvoir toujours disposer de souches viables, les souches isolées et purifiées
sont conservées au réfrigérateur à 4°C jusqu’à utilisation (2 semaines maximum).

1. Etude des caractères culturaux


Le polycopié de systématique bactérienne (cf. cours de Dr. Boussena) donne pour
chaque espèce bactérienne d’intérêt vétérinaire étudiée, les aspects caractéristiques
de sa culture sur les milieux de cultures (liquide et surtout solide). Il est par
conséquence impératif de connaitre ces détails car ils vont servir d’indices
d’orientation pour le choix des tests ultérieurs.
Sur milieu liquide, il sera noté la présence : de trouble plus au moins important, d’un
dépôt (en mie de pain, glaireux …) ou d’un voile.
En revanche, sur les milieux de culture solide seront notés : l’abondance de la culture
et son délai d’apparition, les caractéristiques des colonies isolées et éventuellement,
la présence de pigments soluble (Pseudomonas) ou insoluble (Serratia).
L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de
l'isolement après incubation. Cette étude est basée sur des observations à l’œil nu et
macroscopiques permettant de différencier les caractéristiques des souches étudiées
(l’aspect de colonies caractéristiques de chaque espèce bactérienne est un des
premiers critères d’identification).
Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : les
colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées.

17
-Examen macroscopique
L’observation de l’aspect macroscopique des colonies sous la loupe binoculaire
permet d’effectuer une première caractérisation, avec une orientation possible des
résultats au cours de l’identification (examen facilité sous différents angles
d’éclairage). Les éléments d’identification macroscopiques sont :
1- La forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.
Allure du contour: bords lisses réguliers ou irréguliers, dentelés, déchiquetés
pouvant même présenter parfois des prolongements (tête de méduse).
Relief: surface bombée, demi-bombée, plate.
Centre: parfois surélève, parfois ombiliquée (en creux).
2- La taille des colonies par la mesure du diamètre : punctiformes ou de taille
mesurable. La taille d’une colonie ne peut être apprécié que si elle est suffisamment
isolée (les colonies serrées les une contre les autres n’atteignent pas leur taille
maximale). Il ne faut pas tout de même oublier que certaines bactéries donnent des
colonies qui s’étalent en vieillissant. Par conséquence, les colonies ne sont
comparables quant à leur taille que dans les zones du milieu de culture présentant
une densité de culture identique.
3- La couleur de la colonie et l’opacité (opaque, translucide ou transparente…). La
transparence des colonies doit être appréciée en lumière naturelle et artificielle.
Certaines colonies élaborent des pigments ce qui représente un élément précieux
d’identification (ex. colonies jaune doré pour Staphylococcus aureus).
4- L’aspect : colonie lisse (S pour smooth), rugueuse (R pour rough) ou muqueuse
(M).
5- l’odeur dégagée par l’ensemble de la culture.
6- l’adhérence appréciée par raclage à l’aide de l’anse de platine.

Fig. 6 : Formes de colonies.

18
2. Etude des caractères morphologiques (aspect microscopique)
2.1. Etat frais
Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et surtout la mobilité des
bactéries. Il consiste en l’observation d’une goutte de suspension bactérienne,
préparée avec de l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation
se fait sur microscope optique.

2.1.1 Mode opératoire


-Déposer une goutte d'une suspension bactérienne (de 1 à 10 colonies placées dans
5 ml de l’eau physiologique) sur une lame de verre (Fig. 7(a)).
-Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la suspension ne doit pas déborder
les contours de la lamelle) (Fig. 7(b)).
-Fixer la lamelle avec 4 perles de paraffine fondue (Fig. 7(b)).
-Luter la lame avec de la paraffine fondue (Fig. 7(c)).
-Observer immédiatement au microscope (objectif x40, condenseur non relevé au
maximum, diaphragme non complètement ouvert).
-Après observation jeter immédiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de
Javel.

(b)
(a)

(c)

Fig. 7 : Etapes de l’état frais.

19
2.1.2 Observation au microscope
Elle se fait en lumière blanche, éclairage direct de la préparation. Condensateur
baissé si le microscope le permet. Diaphragme fermé (lumière minimale). Objectif x
40 à sec (sans huile). Pour la mise au point, l’objectif est à environ 1 mm au-dessus
de la lamelle.

2.2 Techniques de coloration simple : bleu de méthylène

2.2.1 Technique
-Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche : avec une anse on étale
doucement un peu de suspension bactérienne sur le milieu de la lame.
-Sécher.
-Fixer à l’alcool et rincer à l’eau, ou fixer à la flamme en passant la lame trois fois
dans la flamme du bec Bunsen réglé en flamme éclairante (virole fermée).
-Recouvrir d’une solution de bleu de méthylène pendant une minute.
-Rincer et sécher entre deux papiers-filtres.
-Eliminer l’humidité résiduelle au-dessus de la veilleuse du bec Bunsen.

2.2.2 Observation
Les bactéries sont tuées, fixées sur la lame et colorées. Condensateur monté jusqu’à
la lame si le microscope le permet. Diaphragme ouvert (maximum de lumière).
Objectif x 100 à immersion (avec huile). Pour la mise au point, l’objectif trempe dans
la goutte d’huile. Nettoyer au papier Joseph après utilisation de l’objectif.

2.3 Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram


C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement
(mode d’assemblage), la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des
cellules purifiées. Cette coloration permet de classer les bactéries selon leur capacité
à fixer le cristal violet. Celles qui possèdent une enveloppe externe sont décolorées
lors du lavage à l’éthanol (Gram-), alors que celles qui n’en possèdent pas vont
retenir le colorant (Gram+).
La consistance et la valeur de la coloration de Gram correspond à des différences
biochimiques entre la paroi des bactéries Gram positif et les bactéries Gram négatif.

20
2.3.1 Technique (cf. Fig. 8)
- Préparer et fixer un frottis bactérien à la chaleur du bec Bunsen.
- Recouvrir au violet de Gentiane (cristal violet) pendant 1min. Eliminer l'excès par
l'eau courante;
- Ajouter du Lugol (mordant) et appliquer pendant 1min, jeter l'excès par l'eau
courante;
- Traiter à l'alcool 95° pendant quelques secondes (10-15 secondes), puis rinçage à
l'eau;
- Recolorer à la Fuschine (safranine) pendant 60 à 75 secondes, rinçage à l'eau puis
séchage.
Les bactéries Gram positif se colorent en violet alors que les Gram négatif se
colorent en rose.

Fig. 8 : Etapes de la coloration de Gram.

2.3.2 Observation
L'observation se fait en ajoutant de l'huile à immersion et au plus fort grossissement
(grossissement : objectif x 100) en lumière blanche (lumière maximale).

21
TP. N° 3. LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE (suite) :
II. Etude des caractères biochimiques

Objectifs : Identification des bactéries à partir de prélèvements préalablement ayant


subis l’isolement et la purification, par l’étude des caractères biochimiques.
En plus de l’étude des caractères morphologiques et culturaux, on identifie aussi une
bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat. On la met donc en contact
dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus
complexes. En général, l'utilisation d’un substrat est révélée par le virage d'un
indicateur de pH (par exemple : un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide
donne un produit basique, etc..) mais toujours appréciée à l’œil nu.
Chaque espèce de bactéries a des caractères propres, on peut donc les rassembler
facilement avec des caractéristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou
sans oxygène, la réduction des nitrates, etc. La combinaison de différents résultats
obtenus permet de définir le profil métabolique de la bactérie analysée ce qui permet
de l’identifier (on ne peut conclure à une identification que sur un ensemble de
caractères).
Pour que les résultats de l’étude des caractères biochimiques soient interprétables,
certaines conditions doivent être respectées :
-La pureté de la souche doit être vérifiée : l’identification doit être effectuée à partir
d’une colonie isolée prélevée sous la loupe (possibilité d’avoir deux colonies qui se
développent l’une sur l’autre). Il faut pratiquer un nouvel isolement à partir de la
suspension bactérienne utilisée pour l’ensemencement de la galerie d’identification
afin de déceler une éventuelle contamination en cours de travail.
Les repiquages fréquents et les transferts en milieux liquides doivent être évités
avant l’identification, en raison des possibilités de mutations qu’ils entraînent.

1. Préparation de la suspension bactérienne


Les colonies (de forme, de taille, de couleur et d’aspect variables d’une bactérie à
une autre) sont par définition des amas de bactéries toutes identiques issues d’une
cellule originelle. Il arrive parfois qu’une colonie soit mixte, formée de deux colonies
différentes superposées provenant de deux cellules bactériennes réunies au même
endroit.

22
La purification devrait procéder toute identification bactérienne entreprise à partir
d’une colonie isolée.

La méthode de suspension directe est une méthode de remplacement pratique pour


préparer l’inoculum de certaines bactéries exigeantes ou non (ex. : streptocoques,
staphylocoques dorés…etc.). Les étapes suivantes sont alors réalisées pour
préparer une suspension bactérienne :
1. Repiquer une colonie bien isolée de la bactérie à étudier sur une gélose sang et
laisser incuber 18 à 24 heures.
2. À l’aide d’une anse de platine, racler, au minimum, de 3 à 5 colonies bien isolées
et identiques de la bactérie étudiée et ensemencer dans un tube contenant de 4 à 5
ml d’un bouillon nutritif stérile (tel que Medium Api) ou dans une solution saline stérile
(utilisée surtout pour l’ensemencement de la galerie classique d’identification).
3. Le bouillon de culture est incubé à 35°C jusqu’à l’apparition d’une turbidité égale
ou supérieure à la turbidité du tube étalon 0,5 de McFarland (en général, délai de 2 à
6 heures) (cf. TP antibiogramme).
4. Ajuster la turbidité du bouillon de culture en phase de croissance avec de la saline
stérile (sérum physiologique) ou du bouillon stérile pour obtenir une turbidité
optiquement comparable à celle du tube étalon 0,5 de Mc Farland
(approximativement 1 à 2 X 108 UFC/ml pour E. coli par ex.). Le tube étalon est agité
à l’aide d’un agitateur électrique avant l’ajustement.
Remarque : En cas d’utilisation d’une solution saline stérile, la turbidité doit être
ajustée dès le début et l’incubation est à proscrire.
Pour effectuer cet ajustement de turbidité, on peut utiliser la comparaison visuelle. La
méthode visuelle consiste à comparer visuellement le bouillon de culture en phase
de croissance et le tube étalon en les plaçant devant une série de lignes noires sur
un fond blanc en présence d’une source de lumière adéquate.
5. L’inoculum bactérien devrait être ensemencé sur les milieux d’identification au
cours des 15 minutes qui suivent l’ajustement de sa turbidité.

2. Recherche de l’enzyme respiratoire


Des tests d’orientation rapides sont réalisés en fonction du Gram et des résultats des
caractères morphologiques et culturaux.

23
2.1 Test de catalase
C'est une enzyme décomposant l'eau oxygénée en eau et en oxygène gazeux.
H2O2 ½O2 + H2O
La méthode consiste à prélever une colonie du germe à étudier (ex. les
staphylocoques pour les Gram + et les entérobactéries pour les Gram -) sur
l'extrémité d'une anse de platine que l'on plonge ensuite dans une goutte d'eau
oxygénée (à l’aide d’une pipette Pasteur). Le dégagement de bulles gazeuses signe
la présence de l'enzyme (cf. Fig. 9).

Fig. 9 : Test de catalase.

2.2 Test d’oxydase


Appelé aussi phénylène diamine oxydase est une enzyme intervenant dans divers
couples d'oxydo-réduction. Ce test est à la base de l’identification des bactéries
Gram (–).
Placer un disque d’oxydase sur une lame propre et stérile. Déposer à l’aide d’une
pipette Pasteur (il est strictement interdit d’utilisé l’anse de platine pour ne pas
fausser le résultat) une goutte de suspension bactérienne pure sur " un disque
oxydase", celui-ci contient de l’oxalate de diméthyl paraphénylène diamine. Les
bactéries oxydase-positives donnent rapidement une coloration violette foncée ; dans
le cas contraire, il n’ya pas de coloration (cf. Fig. 10).

24
Fig. 10 : Test d’oxydase.

2.3 Nitrate réductase NR


En l’absence d’oxygène, certaines bactéries peuvent obtenir leur énergie par
respiration anaérobie. Cette respiration anaérobie est liée à l’activité d’enzymes
localisées dans la membrane plasmique bactérienne.
Ce test consiste à mettre en évidence les nitrites ou la disparition des nitrates
initiaux. Elle utilise deux types de réactifs (réactifs de Griess) : l’acide sulfanilique
(nitrite 1) et l’α-naphtylamine (nitrite 2) en solution (dans l’acide éthanoïque). (cf. Fig.
11a et 11b)
NO3- + 2H+ + 2e- NO2- + H2O

La recherche peut s’effectuer à partir de milieu gélosé nitraté, de bouillon nitraté ou à


partir du milieu mannitol mobilité.
La coloration rouge témoigne la présence des nitrites dans le milieu (NR+).
Si le milieu reste inchangé : on ajoute alors de la poudre de zinc qui joue le même
rôle que le nitrate réductase vis à vis des nitrates.
Présence de coloration rouge : on a donc eu transformation des nitrates en nitrites
par le zinc. La bactérie ne possédait pas cette enzyme. Résultat NR-.
Pas de coloration : les nitrates ont été transformés par la bactérie au delà des
nitrites. La bactérie possède cette enzyme. Résultat NR+ au stade azote.

25
Fig. 11 (a) : Test du nitrate réductase.

26
Fig. 11(b) : Test de nitrate réductase.

27
3. Quelques milieux d’identification (galerie classique)
Les tests biochimiques abordés dans le présent manuel correspondent à la galerie
classique des bactéries Gram négatif. Il est a rappelé que cette liste n’est pas
exhaustif et que elle a été choisi en fonction des tests disponibles au niveau du
laboratoire pédagogique. Compte tenu des changements possibles de la disponibilité
des tests biochimiques au niveau du laboratoire pédagogique, l’enseignant chargé
des travaux pratiques peut développer d’autres tests non abordés dans le présent
manuel ainsi que leur contexte de réalisation (coagulase, lipase, DNase, …).

3.1 Milieux pour l’étude des métabolismes protéique, glucidique et


énergétique
3.1.1 Production d’uréase (métabolisme protéique)
Les milieux synthétiques les plus couramment utilisés "Urée-Indole" de Ferguson
sont ensemencés avec des souches isolées sur milieux gélosés (ne jamais utilisé
des souches cultivées sur géloses).
La culture est effectuée sur urée- indole (exempte d’indole) à partir d’une colonie de
la souche à étudier et incubée par la suite 24-48h à 37°C.
Le milieu urée-indole est un milieu complexe qui fournit un ensemble de résultats
utiles à l'identification de nombreux germes bactériens, notamment parmi les
Enterobacteriaceae.
L'uréase, enzyme hydrolysant l’urée, activité directement détectable par le suivi de
l'alcalinisation (virage spontané). La coloration rouge traduit une alcalinisation du
milieu, suite à l'hydrolyse de l'urée et formation de carbonate d'ammonium: uréase+.
Après la lecture de l’urée, on procède à la lecture de l’indole sur le même tube.
Certaines bactéries dégradent le tryptophane (présent dans la plupart des protéines)
en indole grâce à une tryptophanase.
Tryptophane Indole+ Pyruvtae+ NH3
L’indole produit est révélé par des réactifs divers (virage non spontané nécessitant
l’addition de réactif)), le plus utilisé est le réactif de Kovacs. La culture est
additionnée de réactif de Kovacs (contenant le diméthyl-amino-4-benzaldéhyde qui
réagit avec l’indole); si l’espèce bactérienne est indole (+), un anneau rouge apparait
à la surface du milieu ; si au contraire elle est indole (-), il y a un anneau jaune ou le
milieu demeure inchangée.

28
3.1.2 Milieu Kligler Hajna
Le milieu Kligler-Hajna permet de mettre en évidence la production d’H2S
(métabolisme protéique), la recherche de la de la β-galactosidase en 2ème jour et la
fermentation des glucides (glucose et lactose)
C’est un milieu est conditionné en tubes avec une pente et un culot. C’est un milieu
complexe (cf. Tab.1), qui permet la recherche de plusieurs caractères biochimiques.
Il est très utilisé dans l'identification des Enterobacteriaceae. Il est ensemencé de la
manière suivante :
Ensemencer abondamment la surface par stries serrées ou par inondation, puis le
culot par simple piqûre, à l'aide de la même pipette boutonnée (pipette à bout
fermée). Il est important de ne pas oublier de dévisser partiellement la capsule (le
bouchon) afin de permettre les échanges gazeux. Mettre à l'étuve 18-24h à 37°C.

Tab. 1 : Composition du milieu Kligler-Hajna (pH=7,4-7,5).


Composant Quantité
Extrait de viande de bœuf 3g
Extrait de levure 3g
Peptone (riche en lysine) 20g
NaCl 5g
Citrate ferrique 0,3g
Thiosulfate de sodium 0,3g
Lactose 10g
Glucose 1g
Rouge de phénol (solution à 1%) comme 5mL
indicateur du pH
Agar 12g
Eau distillée (qsp) 1L

a)- Principe de la lecture de la fermentation des glucides :


Le milieu de Kligler contient 2 glucides: glucose et lactose (10 fois plus de lactose
que de glucose). Les entérobactéries utilisent d'abord le glucose et ensuite,
éventuellement le lactose. La production de gaz se traduit par l’apparition de bulles
au niveau du culot, ou encore par la formation d’une poche qui décolle complètement
le milieu du fond du tube.

29
Fig. 12 : Test Kligler Hajna.
Tube C : Tube témoin négatif.
Tube n°1 : Bactérie de type oxydatif du glucose ou glucose - et lactose - : culot rouge et pente rouge.
Tube n°2 : Bactérie Glucose, lactose et H2S négatifs.
Tube n°3 : Bactérie de type oxydatif du glucose ou glucose -, lactose - et H2S+ : culot noir et pente rouge.
Tube n°4 : Bactérie de type fermentatif du glucose (+) et lactose + avec production de gaz: culot jaune et
pente jaune.
Tube n°4A : Bactérie de type fermentatif du glucose (+) avec production de gaz et lactose - : culot jaune et
pente rouge.
Tube n°5 : Bactérie de type oxydatif du glucose (+), lactose + sans production de gaz et H2S+ : culot noir et
pente jaune.

Dans le culot (anaérobiose):


Le glucose est dégradé par fermentation, d'où production importante d'acides et
virage du rouge de phénol au jaune. L'utilisation ultérieure du lactose (si elle a lieu)
ne modifiera pas la teinte du rouge de phénol.
On lit donc le caractère glucose dans le culot.

Sur la pente (aérobiose):


Le glucose est attaqué par voie oxydative, d'où production faible d'acides (d'autant
plus faible que la quantité de glucose présent est faible).

30
Si la souche est lactose -, la faible acidité produite sera masquée par l'utilisation des
acides aminés (alcalinisation).
Si la souche est lactose +, il y aura acidification due à l'oxydation du lactose, présent
en quantité importante: virage du rouge de phénol au jaune.
On lit donc le caractère lactose sur la pente.

b)- Principe de la production d'H2S


La mise en évidence de la production d'H2S se fait grâce à la présence de thiosulfate
de sodium et de citrate ferrique (fer III). En effet, chez une souche dite H 2S +:
Le thiosulfate est réduit en anaérobiose en H2S. L'H2S ainsi formé se combine au
citrate de fer présent pour former un précipité de sulfure de fer noir.

3.1.3 Milieu Clark et Lubs


Ce milieu permet l’étude de la voie de fermentation du glucose (tests RM et VP).
L’étude de cette voie permet de différencier les bactéries de la famille des
Enterobacteriaceae (bacilles Gram -, oxydase -).
Bouillon Clark et Lubs est inoculé par une goutte d’une suspension trouble de
bactéries. Après 18h à 37°C, on divise le bouillon dans 2 tubes stériles. Chaque tube
sert à révéler une des 2 voies :
- Voie des Acides mixtes : Addition d’une goutte de rouge de méthyl (test au RM)
- Voie Butylène-Glycolique : Addition de 2 gouttes de KOH à 10% et d’Alpha-naphtol
(réaction de Voges-Proskauer) (cf. Fig. 13).

3.1.3.1. Test RM (rouge de méthyle)


Ce test permet la mise en évidence, grâce au rouge de méthyle, de la fermentation
du glucose en acides mixtes par acidification d'un milieu glucosé.

3.1.3.2. Test VP (Vosges-Proskauer)


Ce test permet la mise en évidence de la production d'acétoïne (ou 3-hydroxy-
butanone) au cours de la fermentation butylène glycolique: en présence d'une base
forte (soude ou potasse) et d'α-naphtol, l'acétoïne donne une coloration rouge en
milieu très oxygéné.
Remarque: le test VP est beaucoup plus spécifique que le test RM qui ne donne
qu'une idée globale du métabolisme.

31
Le test VP est particulièrement intéressant pour caractériser le groupe Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia et Serratia (complexe KEHS cf. cours des entérobactéries).

Fig. 13 : Tests RM et VP.

3.1.4 Citrate de Simmons


Ce milieu est un exemple de milieu synthétique, c'est à dire de milieu dont la
composition, qui est complexe, est connue exactement tant qualitativement que
quantitativement.
Dans ce milieu le citrate (C6H5O73-) est l'unique source de carbone. L'utilisation de ce
substrat, pour la plupart des bactéries pouvant le cataboliser, est une utilisation
aérobie, et se traduira par une alcalinisation du milieu.
L'équation de l'oxydation par respiration aérobie du citrate est :
2 C6H5O73- + 9 O2 -------------> 12 CO2 + 2 H2O + 6 OH-
Le milieu est présenté sous forme de gélose inclinée. La pente est ensemencée par
une strie longitudinale, réalisée à l'anse, à partir d'une suspension de la culture solide
en eau distillée stérile. Il est important de ne pas apporter de substrats carbonés.
Ainsi l'ensemencement à partir d'une souche pure fournie en bouillon nutritif ou en
eau peptonée est impossible. Ne pas visser le bouchon à fond, afin de permettre les
échanges gazeux (en particulier élimination du dioxyde de carbone). Mettre à l'étuve
24 heures à 37°C.

32
Fig. 14 : Test du citrate de Simmons.

Pour la lecture du test, on procède comme suit : (cf. Fig. 14)


- Virage de l'indicateur de pH au bleu : il y a eu alcalinisation du milieu et la souche
est citrate de Simmons +.
- Pas de virage de l'indicateur de pH : il n'y a pas eu alcalinisation et le milieu ne
présente pas de culture. La souche est citrate de Simmons -.
Remarque :
Les causes possibles d’erreurs peuvent s’observer si : i) inoculum apportant une
source de carbone et ii) bouchon mal dévissé

3.1.5 Mannitol-Mobilité
Ce milieu permet l’étude de la fermentation du mannitol (caractère biochimique) et la
mobilité de la souche (caractère morphologique). Ce milieu est utilisable uniquement
pour les bactéries fermentatives. La présence d’une faible teneur d’agar (gélose
molle) rend possible le déplacement des bactéries mobiles autour de la piqûre
centrale (le milieu est ensemencé à l’aide d’un fil de platine ou une pipette Pasteur à
bout fermée et incubé à 37°C pendant 18-24 heures). La lecture de l’utilisation du
mannitol est possible grâce à la présence d’un indicateur de pH, le rouge de phénol.
L’utilisation du mannitol acidifie le milieu qui peut ainsi être révélé par le virage de
l’indicateur de pH à sa teinte acide (jaune).

33
Les bactéries mobiles diffusent à partir de la ligne d’ensemencement, créant un
trouble dans le milieu alors que les bactéries immobiles poussent uniquement le long
de la strie d’ensemencement. La présence de nitrate de potassium permet aussi la
recherche du nitrate réductase grâce à ce milieu (en ajoutant à la surface, les réactifs
de Griess (nitrite 1 et nitrite 2) (cf. test du nitrate réductase).

(a) Test avant


l’ensemencement

(b) Test positif (mannitol+


et mobilité+)

Fig. 15 : Test mannitol mobilité.

4. Galeries de tests biochimiques miniaturisés (galerie Api)


Là où les techniques classiques nécessitaient une à trois semaines, les gammes
miniaturisées permettent l’obtention des résultats sous 18 à 72 heures (rapide). Elles
permettent, en outre, l’identification d’environ 700 bactéries et levures, ce qui couvre
pratiquement une bonne partie des micro-organismes pathogènes et près de 1000
tests biochimiques différents d’usage courant. Les galeries Api (analytical profile
index) sont aussi de réalisation facile et de haute performance (résultat fiable).
Elles se présentent sous la forme d’une série de petits tubes, nommés tubules,
correspondant chacun à un test biochimique spécifique. Chaque tubule est ouvert à
son extrémité supérieure par une cupule pouvant être remplie, ou non, de liquide afin
de placer le tube dans des conditions particulières. Chaque tube contient un substrat
défini (ONPG, ADH, GEL...) et avec lequel les micro-organismes réagissent
différemment.

34
Lorsqu’une suspension bactérienne de densité convenable est répartie dans les
différentes alvéoles qui composent la microgalerie (contenant de substrats
déshydratés), les métabolites produits durant la période d’incubation se traduisent
par des changements de couleur spontanés ou révélés par addition de réactifs.
Elle comprend généralement 20 tests biochimiques.
La première galerie qui a été utilisée est la galerie Api 20 E (Fig. 16), destinée à
l’identification des entérobactéries. Actuellement dans le laboratoire de bactériologie
médicale de l’Institut des Sciences Vétérinaires, seules les galeries Api 20 E, Api 20
NE, Api Staph et Api 20 Strep sont disponibles.

Fig.16 : Galerie Api 20 E.

4.1 Choix de la galerie


Le choix de la galerie à ensemencer dépend des résultats de l’étude des caractères
morphologiques, culturaux et biochimiques qui ont été étudiés précédemment
(oxydase, catalase...) et qui sont indispensables pour l’interprétation de la galerie
Api.
Ainsi, les galeries disponibles dans notre laboratoire permettent d’identifier un
ensemble de bactéries Gram positif et négatif (cf. catalogues analytiques des
galeries) qui présentent un risque négligeable (P1) ou faible (P2) et dont la
manipulation est autorisée aux étudiants dans un laboratoire pédagogique.
-La galerie Api 20 NE est destinée à l’identification des coques ou bacilles Gram
négatif, peu exigeants (bacilles autres que les entérobactéries) et oxydase positif
(Pseudomonas et apparentés, Vibrionaceae, Aeromonadaceae).
-La galerie Api Staph permet l’identification des staphylocoques et des microcoques.
-La galerie Api 20 Strep assure l’identification des streptocoques, entérocoques et
les bactéries apparentées (notamment quelques espèces du genre Listeria) en 4 ou
24 heures

35
-Pour la galerie Api 20 E, les entérobactéries (bacilles Gram négatif, peu exigeants et
oxydase négatif) sont facilement identifiées par le biais de cette galerie. Les
Vibrionaceae, Pseudomonas et les Aeromonodaceae sont également d’identification
possible avec cette galerie.

4.2 Mode opératoire


-Réunir fond et couvercle d’une boîte d’incubation (support de la galerie)et répartir de
l’eau dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide.
-Déposer stérilement la galerie dans la boîte d’incubation.
-Préparer la suspension bactérienne à une opacité 0,5 sur l’échelle Mc Farland (dans
l’ampoule du Medium correspondant à la galerie ou dans un tube d’eau distillée
stérile) (cf. Préparation de la suspension bactérienne).
-Inoculer la galerie : la suspension bactérienne à analyser, souvent obtenue suite à
une purification des colonies bactériennes sur milieux sélectifs, est versée dans
chacun des tubules de la galerie. Pour les substrats dont le nom est encadré, il
convient de remplir la cupule. L’objectif est de réaliser des tests en aérobiose (riche
en oxygène). Pour les substrats dont le nom est souligné, il convient de remplir la
cupule avec de l’huile de paraffine. Cette huile empêche le contact avec l’oxygène,
créant ainsi un milieu anaérobique (absence d’oxygène) et empêche également les
composés volatiles synthétisés lors de la réaction de s’échapper du tube.
-Incuber de 18 à 24h à température adaptée.
-Refermer la boite d’incubation, coder (il convient de noter le code sur la languette
latérale du boitier d’incubation) et placer à 37 °C pendant 18-24 heures.
Remarque : il est important de veiller à ne pas créer de bulles lors de l’inoculation qui
pourraient fausser le résultat. De plus l’apparition de bulles après incubation
apportera un caractère d’identification supplémentaire (GAZ+).

36
Fig. 17 : Préparation de la suspension bactérienne et ensemencement de la
galerie Api 20 E.

Fig. 18 : Ensemencement de la galerie Api 20 E.

37
4.3 Lecture et interprétation des résultats
Pour la lecture, il convient de regarder si la réaction est positive ou négative
séparément pour chacun des tests. La révélation est permise par la présence
d’indicateurs colorés dans les substrats. Un changement de couleur du milieu dans le
tube, signifie généralement que le test est positif. Il faut tout de même ne pas oublier
que certains tests nécessitent l’addition de réactifs.
Un tableau des caractères à vérifier pour chaque milieu est fourni par le fabriquant
afin de permettre l’interprétation des résultats.
Concernant l’interprétation des résultats, les tests sont regroupés par triplet de
gauche à droite. Un test négatif vaut toujours 0. La valeur des tests positifs, quant à
elle, est différente selon la position du test dans le triplet. Dans chacun d’eux, si le
premier test est positif, il vaut 1, si c’est le deuxième, 2, et si c’est le troisième, 4. Il
faut ensuite additionner les trois valeurs obtenues pour obtenir le code du triplet
(seules huit valeurs, de 0 à 7, sont possibles). Un code à sept chiffres est obtenu par
lecture des codes des triplets de gauche à droite. Ce code, comparé à ceux
référencés dans la base de données gérée par le fabricant, permet l’identification de
la bactérie.

Fig. 19 : Fiche de résultats de la galerie Api 20 E.

38
Tab. 2 : Tableau de lecture de la galerie Api 20 E.
Lecture directe ou
Caractère Résultat
Microtube Substrat indirecte (Test si Résultat +
recherché -
nécessaire)
ONPG Ortho-Nitro- β- Lecture directe
Phényl- galactosidase
Galactoside

ADH Arginine Arginine Lecture directe


dihydrolase
LDC Lysine Lysine
décarboxylase
ODH Ornithine Ornithine
décarboxylase
CIT Citrate Utilisation du Lecture directe
citrate

H S Thiosulfate Production Lecture directe


2
de sodium d’H2S

URE Urée Uréase Lecture directe

TDA Tryptophane Tryptophane Lecture indirecte


désaminase Test : ajouter 1
goutte de
Perchlorure de Fer
IND Tryptophane Production Lecture indirecte
d’indole Test : ajouter 1
goutte de réactif de
Kovacs
VP Pyruvate de Production Lecture indirecte
sodium d’acétoïne (Attendre 10
minutes)
Test : ajouter 1
goutte de KOH et
d’α-napthol
GEL Gélatine Gélatinase Lecture directe
emprisonnant
des
particules de
charbon
GLU à Substrat Utilisation de Lecture directe
ARA carboné substrat
carboné

-
NO / N Nitrates Nitrate Lecture indirecte
2 2 (NO3) réductase dans la cupule GLU
Test : ajouter 1
goutte de réactif de
Griess
Ajouter de la poudre
zinc en cas de
résultat négatif

39
Avec le tableau d’identification : comparer les réactions notées sur la fiche de
résultats avec celle du tableau : chaque cellule de ce tableau contient les
pourcentages de positivité • Avec le catalogue analytique : Les tests sont regroupés
en groupe de 3, et une valeur (1, 2 ou 4) est indiquée pour chacun.
Additionner à l’intérieur de chaque groupe les nombres correspondants aux tests
positifs. On obtient un nombre à 7 chiffres qui sert de code d’identification

La lecture peut se faire plus facilement grâce à l’utilisation du logiciel d’identification.


TM
Les bases de données des galeries Api sont désormais intégrées par APIweb afin
de faciliter leur interprétation.

Fig. 20 : Feuille Excel de lecture de la galerie Api (Excel Microsoft).

40
TP. N° 4. ANTIBIOGRAMME

Objectif :
L’antibiogramme a pour but de mettre en évidence les effets des antibiotiques sur les
bactéries isolées au niveau du laboratoire. Elle permettra de répondre aux
hypothèses suivantes :
-Les antibiotiques agissent de manière inégale sur un même type de bactérie.
-Touts les antibiotiques ne fonctionnent pas sur toutes les bactéries.
Il est fondamental de mesurer l’activité des antibiotiques :
- pour sélectionner, in vitro, le ou les antibiotiques actifs sur une bactérie
identifiée ou non ;
- Pour agir vite et éviter la prolifération microbienne et la septicémie.

1. Définition
L’antibiogramme standard est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un ou
plusieurs antibiotiques. L’identification bactérienne devra donc souvent être
complétée par l’antibiogramme (standard). En effet, l'antibiogramme vise à trouver
l'antibiotique le plus efficace sur les bactéries prélevées en cas d’infection
bactérienne, d’exploitées les données pour la surveillance des résistances
bactériennes aux antibiotiques (échange de données par le logiciel WHONET fourni
par l’OMS) et une indication supplémentaire pour l’identification du germe par la mise
en évidence de résistances naturelles.
L’antibiogramme d’une souche peut être déterminé en milieu liquide par la méthode
de la CMI (concentration minimale inhibitrice) ou par la technique des disques.
Il existe aussi des galeries d’antibiogramme qui permettent la catégorisation de la
souche bactérienne à tester par rapport à plusieurs antibiotiques sur les CMI déjà
fixées. Des méthodes dites automatisées permettant l’obtention rapide des résultats
et la reproductibilité des tests ont été récemment développées. Les automates
fonctionnent de la même manière que les galeries mais permettent de tester
plusieurs concentrations d’antibiotiques.
Un antibiogramme doit obligatoirement être effectué sur une culture pure et
identifiée. Cela permet d'ajuster la densité de l'inoculum, de choisir judicieusement
les antibiotiques à tester, et de pratiquer une lecture interprétative.

41
1.1 Limites de l’antibiogramme
L’antibiogramme est réalisé in vitro, tandis qu’une infection bactérienne à plusieurs
composantes qui varient avec le temps : la localisation de l’infection, l’animale, les
concentrations d’antibiotiques et les bactéries. Ainsi, l’antibiogramme ne peut pas
prédire le comportement des antibiotiques in vivo :
-Diffusion au site de l’infection ;
-Choix de posologie ;
-Pénétration dans les cellules ;
-Influence des facteurs physiologiques ou pathologiques ;
-Transformation de la molécule d’antibiotique in vivo ;
-Emergence d'une résistance au cours du traitement ;
-Etat physiologique de la bactérie au sein du foyer infectieux (les bactéries «au
repos» sont insensibles aux antibiotiques qui interfèrent avec la biosynthèse du
peptidoglycane et de même pour les mutants dépourvus de paroi).

2. Antibiogramme par dilution


Dans la pratique courante, les méthodes de dilution sont de mises en œuvre
délicates et/ou coûteuses et elles sont réservées à des laboratoires spécialisés.
Elle est souvent effectuée sur milieu de culture liquide. Elle consiste à mettre un
inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes
d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2.

2.1 Choix du milieu


Détermination de la CMI en milieu liquide doit se faire sur milieu liquide (bouillon). On
utilise le bouillon Mueller-Hinton (MH) ou le bouillon MH au sang de cheval et
additionné de β-NAD (bouillon MH-F).
Le bouillon MH est employé lors de la méthode de dilution en milieu liquide pour les
bactéries autres que celles à croissance lente (bactéries non exigeantes).
Le bouillon MH-F est un bouillon MH additionné de 5% de sang de cheval lysé et de
20 mg/L β-NAD, est employé pour les bactéries exigeantes et/ou à croissance lente
(ex. Streptococcus spp., dont Streptococcus pneumoniae, Haemophilus spp.,
Pasteurella multocida, et autres...).

42
2.2 Préparation de l’inoculum
Cette méthode consiste à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de
concentrations croissantes d'antibiotiques. C’est la méthode de référence (dilution en
milieu liquide ou solide). En revanche, elle est fastidieuse et lente.
En milieu liquide, l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode
de macrodilution) (cf. Fig. 21) ou de cupules (méthode de microdilution).

Fig. 21 : Antibiogramme par dilution (aspect avant ensemencement).

CMI

Fig. 22 : Antibiogramme par dilution (aspect après ensemencement et incubation).

43
Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus
faible concentration d'antibiotique où aucune croissance n'est visible (cf. Fig. 22).
Dans la Fig. 22, la CMI de la souche testée est de 2 μg/mL (premier tube dans lequel
aucune croissance n'est visible à l'œil nu).

La méthode par dilution peut aussi être réalisée en milieu solide ou l'antibiotique est
incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Petri. La surface de la gélose est
ensemencée avec un inoculum des souches à étudier (cf. Fig. 23). Après incubation,
la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu
contenant la plus faible concentration d'antibiotique.
Elle permet également de mesurer la concentration inhibitrice 99% (concentration qui
inhibe la croissance de 99% des cellules d'une souche bactérienne=CMI) ou la
concentration inhibitrice 50% (concentration qui inhibe la croissance de 50% des
cellules d'une souche bactérienne).

Fig. 23 : Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé (1, 2, 3 et 4


représentent les souches bactériennes testées).

3. Antibiogramme par diffusion


La méthode de diffusion est l’une des plus anciennes approches de détermination de
la sensibilité des bactéries aux antibiotiques et demeure l’une des méthodes les plus
utilisées en routine. Elle convient pour la majorité des bactéries pathogènes incluant
certaines bactéries à croissance lente ; elle permet une variété dans le choix des
antibiotiques et ne requiert aucun matériel particulier.

44
Néanmoins, cette technique s'applique mal à l'évaluation de la sensibilité à des
antibiotiques qui diffusent peu dans la gélose (polymyxines ou glycopeptides) et
toute résistance devrait être confirmée par la mesure de la CMI (antibiogramme par
dilution).
L’antibiogramme par diffusion est inadapté pour des bactéries telles que les
mycoplasmes par exemple ; en raison de la petite taille des colonies et de la durée
d'incubation souvent longue. De même, pour les bactéries intracellulaires obligatoires
(Chlamydia, Rickettsia...), l'étude de leur sensibilité aux antibiotiques nécessite le
recours à des techniques particulières rarement effectuées en routine.

3.1 Préparation de l’inoculum


L’inoculum bactérien est préparé en ensemençant dans 5 ml du bouillon nutritif (ou
en milieu salé) au moins trois à cinq colonies bien isolées de même type
morphologique d'une culture sur milieu gélosé, ensuite une incubation sous agitation
(généralement deux à six heures) à 30°C a été réalisée. La turbidité de la culture a
été ajustée avec une solution saline stérile ou du bouillon pour obtenir une turbidité
équivalente à celle d'un standard Mc Farland 0,5 ou à une densité optique de 0,08 à
0,1 lue à 625nm. Il en résulte une suspension contenant environ 1 à 2x10 8 UFC/ml
pour E. coli par exemple voir 1x106 UFC/ml pour d’autres bactéries. L’inoculum peut
être ajusté en ajoutant de l’eau physiologique stérile s’il est trop dense ou de la
culture bactérienne s’il est trop faible.

45
Fig. 24: Etalon de Mc Farland servent de standard de turbidité pour préparer les
suspensions bactériennes.
Pour effectuer cet ajustement de turbidité, on peut utiliser un appareil photométrique
(densitomètre) ou la comparaison visuelle. La méthode visuelle consiste à comparer
visuellement le bouillon de culture en phase de croissance et le tube étalon en les
plaçant devant une série de lignes noires sur un fond blanc en présence d’une
source de lumière adéquate (cf. Fig. 24).
L’inoculum bactérien devrait être ensemencé au cours des 15 minutes qui suivent
l’ajustement de sa turbidité.
Cette méthode convient pour toutes les bactéries y compris à croissance lente dont :
Haemophilus spp., Streptococcus pneumoniae, les streptocoques β hémolytiques.
Remarque : il y a possibilité de réalisation d’un antibiogramme direct sur la primo-
culture sans repiquage pour les prélèvements (LCR, Hémoculture..) réalisés dans
des situations d’urgence.

3.2 Choix des disques d’antibiotiques


Les antibiotiques sont sous forme de disques de papier imprégnés avec une
concentration déterminée d’agent antimicrobien. Ils sont clairement identifiés par un
sigle, comportant 1 à 3 lettres, imprimé de chaque côté du disque.

46
Les disques sont présentés en cartouche de 50 disques conditionnés en containers
étanches contenant un dessicant (agent desséchant). La date de péremption et le
numéro de lot figurent sur chaque conditionnement (cartouche et container).
Le choix des antibiotiques dépend de la souche bactérienne à tester tout en tenant
compte des résistances naturelles
Ainsi pour les Aminosides par exemple, l’existence de nombreuses transférases
différentes capables d’inhiber seulement quelques antibiotiques de la famille, impose
de tester plusieurs antibiotiques.
Pour les Macrolides, il faut toujours employer 2 disques de Macrolides, dont l’un doit
impérativement être l’Erythromycine pour apprécier la résistance MLS (Macrolides,
Lincosamides et Streptogramines) chez des bactéries de type staphylocoques et
streptocoques.
De plus, la résistance étant inductible, il faut par conséquence lire l’antibiogramme au
bout de 24 heures car à 18 heures, la bactérie peut apparaitre faussement sensible.
Pour les Bêtalactamines, le choix de l’Amplcilline intéressant pour les bactéries Gram
négatif, est inutile et même nuisible pour les staphylocoques, car l’Ampicilline est un
moins bon inducteur des β-lactamases que la pénicilline elle-même.
Pour les staphylocoques, il faut tester la Méthicilline.

3.3 Choix du milieu


Milieu recommandé pour l’antibiogramme est le Mueller-Hinton (MH) avec faible
teneur en thymidine ou thymine et un contenu en cations connu. Il peut être préparé
sur place ou acheté prêt à l’emploi. Ainsi, lorsque le MH est coulé dans des boites de
Petri, il faut veiller à ce que l’épaisseur de la gélose est de 3 à 4 mm, car il y a une
possibilité de faux sensibles si l’épaisseur est inférieure à 3 mm et de faux résistants
si l’épaisseur est supérieure à 4 mm. En résumé, Répartir le milieu en boîtes de Petri
stériles de façon à obtenir une épaisseur de 4 mm ± 0.5 mm (soit environ 25 mL par
boîte de Petri de 90 mm de diamètre, 31 mL par boîte de Petri de 100 mm de
diamètre, 71 mL par boîte de Petri de 150 mm de diamètre, 40 mL par boîte de Petri
carrée de 120 mm).
Le pH du la gélose MH doit être entre 7,2 et 7,4 (ex. : la tétracycline donne des
zones plus petites si le pH est trop élevé et vice versa).
La gélose MH est employée lors de la méthode de diffusion en gélose pour les
bactéries autres que celles à croissance lente (bactéries non exigeantes).

47
La gélose MH-F additionnée de 5% de sang de cheval défibriné mécaniquement et
de 20 mg/L de β-NAD, est employée pour Streptococcus spp. dont Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus spp., Pasteurella multocida, … et autres bactéries à
croissance lente.
Conserver les boîtes préparées au laboratoire à 8-10°C. Si elles sont conservées au-
delà de 7 jours, les conserver à 4-8°C en sachet plastique scellé.

3.4 Mode opératoire


3.4.1 Ensemencement par écouvillonnage
Plonger un écouvillon en coton stérile dans la suspension bactérienne et éliminer
l’excès de liquide en tournant l’écouvillon sur les parois du tube.
Il est important de rejeter l’excès de liquide pour éviter une sur-inoculation des
boîtes, en particulier pour les bactéries à Gram négatif. La gélose Mueller-Hinton est
ensemencée par écouvillonnage en stries serrées. Pour écouvillonner la totalité de la
surface de la gélose, l’opération a été répétée encore deux fois, en tournant la boîte
de 60° à chaque fois (trois directions) sans oublier de faire pivoter l’écouvillon sur lui-
même et de passer l’écouvillon sur la périphérie de la gélose (pourtour de la gélose).
Il est à noter qu’il faut recharger l’écouvillon à chaque ensemencement s’il y a
plusieurs boites à ensemencer. L’ensemencement peut se faire aussi en utilisant un
ensemenceur rotatif.

3.4.2 Ensemencement par inondation


Prélever 3 à 5 ml de la suspension bactérienne et les mettre dans une boite de Petri
dont il faut inonder la surface (de toute la plaque gélosée) par une légère rotation de
la boite (ensemencement par inondation), laisser la boite inondée pendant quelques
minutes (de 3 à 5 minutes et ne jamais excéder 15 minutes) afin que la gélose puisse
absorber l’humidité à la surface et éliminer ensuite l’excès dans un récipient
contenant un antiseptique, laisser sécher la boite entrouverte à l’étuve pendant 5 à
10 minutes.
L’inoculum doit être toujours de bonne concentration (vérifier à l’aide d’un
spectrophotomètre) et provient d’une culture jeune, car un inoculum trop faible peut
donner des colonies isolées.

48
3.4.3 Application des disques
Laisser réchauffer les disques à la température de la pièce (environ 1 à 2 heures)
avant de les utiliser.
Répartir les disques uniformément sur la gélose: généralement ≤ 12 disques pour la
boite de Petri de 150 mm de diamètre ou ≤ 5 disques/boite de Petri de 100 mm sauf
exception (p. ex., pneumocoque ≤ 9 disques pour la boite de Petri de 150 mm de
diamètre ou ≤ 4 disques pour la boite de Petri de 100 mm de diamètre).
En général, pour la boite de 90 mm de Diamètre, on n’utilise pas plus de 6 disques.
Les disques doivent être espacés minimum de 24 mm centre à centre.

Appliquer ensuite des disques d’antibiotiques à la surface de la surface de la gélose.


Incuber 18 à 24h à 37°C. Il est très important de respecter la durée d’incubation : en
général, de 16 à 18 heures sauf par exemple dans le cas de Staphylococcus sp. et
Enterococcus sp. où l’incubation est de 24 heures pour certains antibiotiques.
Une incubation trop longue peut fausser les résultats.
L’incubation se fait généralement en aérobiose, avec humidité, sauf si indication
contraire : incubation en CO2 diminue le pH et peut modifier l’activité de certains
antibiotiques.

Enfin les disques d’antibiotiques doivent être appliqués sur la gélose en pressant
chaque disque à l’aide de pinces bactériologiques stériles pour s’assurer de leur
application et ils ne doivent pas être déplacés même si mal placés car, la diffusion
des antibiotiques est très rapide. Il existe éventuellement des distributeurs
automatiques des disques d’antibiotiques.
Dès lors que l’emballage a été ouvert, les disques doivent toujours être réfrigérés
s’ils ne sont pas utilisés. Éviter de les laisser plusieurs heures à la température de la
pièce. Une cartouche ouverte doit être utilisée dans un délai de 5 jours qui suivent
l’ouverture.
Les disques d’antibiotiques doivent être conservés selon la nature des antibiotiques
comme suit :
- Congélateur avec givre à ≤ -14°C, avec dessiccateur;
- Réfrigérateur à 2-8°C, avec dessiccateur ;
- Antibiotiques thermolabiles (≤ 1 sem.) : réfrigérateur à 2-8°C, avec dessiccateur.

49
3.5 Lecture et interprétation
La croissance se traduira par l’apparition d’une nappe à la surface de la gélose sauf
aux endroits où ont été déposés les disques d’antibiotiques auxquels la souche est
sensible (cf. Fig. 25). Si la souche est sensible à un antibiotique, il y aura une zone
d’inhibition autour du disque (appelée plage de lyse ou zone d’inhibition) (cf. Fig. 26
et 27).
Les zones d’inhibitions doivent êtres mesurées au millimètre le plus proche à l’aide
d’un pied à coulisse appliqué sur le fond de la boîte de Petri fermée (ou un compas
appliqué en contact de la gélose) et comparées avec les valeurs critiques. Les
diamètres des zones d’inhibition peuvent être mesurés avec une règle (cf. Fig. 26) ou
encore un système de lecture automatisé.

Fig. 25 : Antibiogramme par diffusion.

La lecture se fait en déposant la boîte sur un fond noir et en utilisant une lumière
réfléchie. Il faut s’assurer que tous les étudiants respectent les mêmes critères.
La lecture du même test doit être faite par plusieurs étudiants : variation maximale de
± 2 mm d’un lecteur à un autre puis validation du résultat.

50
Fig. 26 : Lecture de l’antibiogramme par diffusion.

Fig. 27 : Schéma en coupe d’une gélose Mueller-Hinton utilisée pour un


antibiogramme standard.
d : diamètre du disque d’antibiotique (6,35 mm)
∅ : diamètre d’inhibition mesuré

51
Les diamètres des zones d’inhibition mesurés seront comparés aux diamètres
critiques donnés par les instances en vigueur (Réseau Algérien de la Surveillance de
la Résistance des Bactéries aux Antibiotiques : RASRBA et Clinical Laboratory
Standards Institute : CLSI) afin de classer la bactérie dans l’une des catégories
Résistant, Intermédiaire, Sensible.
Les résultats d’un antibiogramme sera réalisé en reportant les diamètres d’inhibition
mesurés ∅ pour chaque antibiotique et les diamètres critiques dans un tableau (Tab.
3). Une colonne permettra d’interpréter la résistance ou la sensibilité de la souche
pour chaque antibiotique.

Tab. 3 : Exemple des résultats d’un antibiogramme standard


Antibiotique Sigle d(CCsup) D(CCinf) ∅ (mm) Interprétation
(mm) (mm)
Acide FA 22 15 24 S
fusidique
Amoxicilline AMX 14 21 17 I
Gentamicine GM 16 18 12 R
dCCsup : diamètre correspondant à concentration critique supérieure
DCCinf : diamètre correspondant à concentration critique inférieure
∅ : Diamètre mesuré
Les concentrations critiques sont établies sur la base des concentrations sériques obtenues après
administration d’une posologie «usuelle» (c) et de la posologie maximale tolérée (C).

On peut en déduire (Tab. 3) si une bactérie est résistante (R), intermédiaire (I) ou
sensible (S) à un antibiotique, et donc adapter l'antibiothérapie, pour proposer au
patient l'antibiotique le plus efficace pour son infection.
• Les souches catégorisées S (souches sensibles) sont celles pour lesquelles la
probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d’un traitement par voie
systémique (générale ou orale) avec la posologie recommandée : CMI < ou égale à
la concentration critique basse.
• Les souches catégorisées R (souches résistantes) sont celles pour lesquelles il
existe une forte probabilité d’échec thérapeutique quels que soient le type de
traitement et la dose d’antibiotique utilisée : CMI > à la concentration critique haute.
• Les souches catégorisées I (souches de sensibilité intermédiaire) sont celles pour
lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible.

52
Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in
vitro ne sont pas prédictifs d’un succès thérapeutique.
En Zone intermédiaire, l'efficacité de l'antibiotique sur la bactérie n'est pas sûre. Il
vaut mieux alors prendre un autre antibiotique, auquel la bactérie est sensible.
Les souches catégorisées I sont celles pour lesquelles la CMI mesurée (ou le
diamètre) est supérieure à la concentration critique basse et inférieure ou égale à la
concentration critique haute (raisonnement identique pour les diamètres vis-à-vis des
diamètres critiques correspondants). La probabilité de succès thérapeutique est forte
uniquement dans le cas d’un traitement par voie systémique avec une posologie
forte ou lorsque l’antibiotique se concentre au site de l’infection (voie locale).
Pour une information complète des prescripteurs, cette catégorie intermédiaire va
devenir « sensible à forte posologie ».
Pour certains antibiotiques il n’y a qu’une seule concentration critique, donc il n’existe
pas de catégorie intermédiaire. En cas de sensibilité (CMI mesurée inférieure à la
concentration critique), il convient de suivre attentivement les recommandations, car,
dans certains cas, seule la forte posologie est recommandée.

4. E-test
La commercialisation d'une technique rapide et simple, le E-test permet à un
laboratoire une estimation indirecte de la CMI.
Le Etest®, technique en milieu gélosé, permet de déterminer la CMI grâce à
l'utilisation de bandelettes imprégnées d'un gradient exponentiel continu de
l'antibiotique à tester.
Le principe du Etest® est basé sur l’association des caractéristiques des méthodes
de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes (supports inertes,
hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont appliquées sur la
surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un inoculum de la souche
à étudier.
Après incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d'inhibition
dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI (cf. Fig. 28).
Une échelle de lecture, imprimé sur la bandelette, permet une interprétation rapide.

53
Fig. 28 : Détermination de la CMI par le E-test.

5. Association d’antibiotiques
L'interaction de deux antibiotiques (A et B) peut produire quatre principaux effets :
• effet synergique : l'effet de l'association est supérieur à la somme des effets
produits par chacun des antibiotiques pris isolément. L’effet (A+B) > effet A + effet B ;
• effet additif : l'effet de l'association est légèrement supérieur à la somme des effets
produits par chacun des antibiotiques pris isolément. L’effet (A+B) = effet A + effet B ;
• effet indifférent : l'activité d'un antibiotique n'a aucune influence sur l'activité de
l'autre. L’effet (A+B) = effet A ou effet B ;
• effet antagoniste : l'effet de l'association est inférieur à la somme des effets produits
par chacun des antibiotiques pris isolément. L’effet (A+B) < effet A ou effet B.

54
Fig. 29 : Test de synergie positif (aspect en bouchant de champagne).

L'utilisation d'une association d'antibiotiques est justifiée dans trois cas :


- Obtention d'un effet bactéricide maximal ;
- Élargir le spectre d'activité dans les cas d'infections à germes multiples ou non
documentée ;
- Prévenir et limité l’émergence la sélection de mutants résistants lors des
traitements de longue durée (par exemple, lors d'infections à mycobactéries ou à
brucelles).

55
REFERENCES
-Anonyme 1 (2014) : Croissance des bactéries. Collégiale des enseignants de
bactériologie-virologie-hygiène, Université Médicale Virtuelle Francophone.

-Anonyme 2 (2014) : TP Introduction à la microbiologie. https://pagesperso.univ-


brest.fr/~maignien/teaching/L1-Bio_TP_microbio/TP-L1-2014.pdf

-Anonyme 3 (2010-2011) : TP de microbiologie, Université de Tours, France, 8


pages. http://microbiologie.univ-tours.fr/poly3_tpl3_2010_11.pdf

-Bendjama A. (2018) : Métabolisme biochimique bactérien. Cours de Bactériologie,


Université de Sétif. https://cours-examens.org/images/An-2018/Etudes-
superieures/Biologie/Bacteriologie/Setif/3.pdf

-Bent Mohamed A., Mint Sidi Baba A. (2007-2008) : manuel de travaux pratiques de
microbiologie, Université de Nouakchott, 27 pages.

-Bourdon J. L., Marchal N. (1973) : Techniques bactériologiques. Doin Editeurs, Paris


France, 335 pages.

-Haichour N. Travaux pratiques de microbiologie générale. Université Ferhat Abbas


Sétif, 18 pages.

-Kayser F.H., Böttger E. C., Deplazes P., Haller O. et Roer A. (2008) : Manuel de
poche de microbiologie médicale 2ème édition Médecine Sciences Flammarion,
France, 764 pages.

-Marchal N., Bourdon J. L. (1973) : Milieux de culture et identification biochimique


des bactéries. Doin Editeurs, Paris France, 179 pages.

-Ministère de la Santé, de la Population et de la Réforme Hospitalière (2005) :


Standardisation de l’antibiogramme en médecine humaine à l’échelle national selon
les recommandations de l’OMS. 4ème Edition Institut Pasteur, Algérie, 94 pages.

-Société Française de Microbiologie (2018) : Comité de l’antibiogramme de la


Société Française de Microbiologie : Recommandations 2018 V.2.0 Septembre. In :
CASFM / EUCAST : Société Française de Microbiologie 133 pages.

56