Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
AVANT-PROPOS
Le présent manuel constitue un recueil des travaux pratiques de bactériologie
destiné non seulement aux étudiants préparant leur diplôme de docteur vétérinaire
mais aussi aux enseignants de l’Institut des Sciences Vétérinaires. Afin de s’assurer
que les membres de l’équipe de bactériologie conservent, complètent et améliorent
leurs compétences et ont accès à des outils appropriés pour les guider lors des
travaux pratiques, nous avons soigneusement mis en place ce document avec
l’essentiel des connaissances et des techniques requises en bactériologie.
Concernant la formation des étudiants vétérinaire, ce manuel vise aussi à apporter,
les connaissances sur un ensemble de pratiques réalisées dans le laboratoire afin
d’identifier les bactéries pathogènes issues de divers prélèvements provenant
d’animaux de compagnie ou de rente.
Ainsi, quatre séries de travaux pratiques ont été établies avec toute la rigueur
nécessaire ainsi que l’adaptabilité exigée par les circonstances (laboratoire
pédagogique) et les disponibilités (milieux de cultures et réactifs) du laboratoire de
bactériologie médicale de l’Institut des Sciences Vétérinaires.
Un premier TP intitulé "Laboratoire de bactériologie " traite les consignes de sécurité,
l’organisation et les équipements ainsi que les principales manipulations de base
exercées au niveau du laboratoire de bactériologie médicale. Il est à noter que les
différentes parties abordées dans cette section ont été présentées tout en accordant
une importance particulière à la protection du manipulateur sans compromettre la
qualité des résultats. Un deuxième et un troisième TP réunirent les renseignements
relatifs aux étapes du diagnostic bactériologique et les critères à étudier afin
d’identifier des bactéries pathogènes en particulier d’intérêt vétérinaire préalablement
isoler au sein du laboratoire. Dans un dernier et quatrième TP, l’étude de la
sensibilité des bactéries aux antibiotiques (réalisation de l’antibiogramme, lecture et
interprétation des résultats) a été présentée d’une manière traduisant l’importance de
ce test dans la pratique vétérinaire.
Enfin, il s’avère judicieux de préciser que les renseignements contenus dans le
présent document ne sont pas exhaustifs ; elles feront l’objet de révisions, et toute
suggestion susceptible d’améliorer le contenu sera accueillie avec grand intérêt.
1
Manuel des Travaux Pratiques ___________________________________________ Dr. BOUSSENA
2
Le contrôle de qualité (contrôle de stérilité, contrôle de qualité de substances
inhibant (antibiotiques par ex.) ou favorisant la croissance bactérienne fait également
partie des missions des laboratoires de bactériologie.
3
1.1.3 Niveau de confinement 3
Ce niveau de confinement permet la manipulation des agents du groupe de risque 3.
Les agents pathogènes étudiés en niveau de confinement 3 sont transmissibles par
voie aérienne même à faible dose infectieuse, qui est susceptible de provoquer des
maladies graves, voire mortelles. Des barrières primaires et secondaires
additionnelles sont nécessaires pour limiter la libération d’organismes infectieux dans
le laboratoire et dans l’environnement. Il est par conséquence exigé une protection
respiratoire appropriée, des filtres spéciaux pour traiter l’air évacué du laboratoire et
un accès strictement contrôlé au laboratoire pour la prévention de la transmission de
tels organismes.
Agents du groupe de risque 3 : Agents pathogènes responsables généralement
d’une maladie humaine grave ou présentant de lourdes conséquences économiques,
mais qui se transmet exceptionnellement par simple contact de personne à personne
et qui cause rarement des maladies ne pouvant pas être traitées par des agents
antimicrobiens ou antiparasitaires. Les risques sont importants pour les
manipulateurs mais faibles pour la collectivité.
4
2. Laboratoire de bactériologie médicale de l’ISVK : les différents locaux de
travail et les postes de manipulation
Le laboratoire de bactériologie de l’Institut des Sciences Vétérinaires d’El Khroub
(ISVK) est en charge des travaux pratiques en bactériologie médicale et des
cliniques des maladies infectieuses. Son activité de conseil s’étend du prélèvement
des échantillons jusqu’à l’interprétation finale des résultats.
Au niveau de son bureau d’accueil, le laboratoire reçoit des prélèvements apportés
par les étudiants vétérinaires, les vétérinaires praticiens, les éleveurs et les
propriétaires des animaux de compagnies. Ces prélèvements utilisés comme
produits pathologiques servent comme outils pédagogique pour la formation des
étudiants lors des travaux pratiques et des cliniques.
Les échantillons présentant un danger biologique sont orientés vers d’autres
laboratoires (zone de tri). Les échantillons ainsi acceptés sont alors identifiés par des
codes enregistrés qui les suivront tout au long de leur parcours dans le laboratoire.
En fonction des examens demandés, les échantillons peuvent être analysés par
colorations et observations microscopiques ou être mis en culture afin d’isoler et
d’identifier par la suite les bactéries pathogènes en cause. Des tests
d’antibiogramme sont éventuellement réalisés pour l’optimisation de l’antibiothérapie.
Les résultats de ces analyses sont ensuite enregistrés manuellement dans un
registre de laboratoire ou informatiquement. Les étudiants sous la supervision des
enseignants participent aux différentes taches de manipulations effectuées lors du
diagnostic bactériologiques (microscopie, culture, identification biochimique, et tests
de sensibilité aux antibiotiques).
Le laboratoire de bactériologie médicale de l’Institut des Sciences Vétérinaires d’El
Khroub dispose aussi de 4 principales pièces techniques (compartiments) distinctes
et suffisamment séparées, réservées exclusivement aux analyses de bactériologie ;
- la première pièce est réservée aux manipulations stériles, les colorations, les
observations microscopiques, l’incubation et la conservation des produits
pathologiques,
- le second compartiment (deuxième pièce) est réservé à la préparation des milieux
de culture, d’identification et de conservation …,
- le troisième compartiment est consacré à l’autoclavage et la stérilisation des
déchets des manipulations.
5
Cette conception a été adoptée afin de respecter l’évolution du travail dans le temps
et surtout de réaliser les travaux pratiques dans des conditions d’hygiène et de
sécurité. Il est à noter qu’une dernière pièce (quatrième) semblable à la première
dédiée aux manipulations stériles a été conçue afin de permettre à plusieurs
personnes de manipuler au même temps.
Le laboratoire est munit de deux accès afin de limiter le croisement des flux.
6
- L’étudiant(e) doit éviter de se déplacer en cours de travail, il doit travailler
assis(e), sans geste brusque.
- Ouvrir avec précaution dans la zone de stérilité d’un bec bunsen [un espace
restreint délimité par un rayon de 10cm autour de la flamme d’un bec Bunsen
réglé en intensité moyenne (flamme bleu) (cf. Fig. 1)] les récipients contenant des
cultures microbiennes, afin d'éviter toute projection.
- Les tubes ou les flacons ne sont jamais tenus verticalement mais obliquement,
leur ouverture dirigée vers la flamme.
Les pipettes, pipettes Pasteur ou pipettes graduées doivent être maintenues en
position oblique, leurs pointes dirigées vers le bas.
- D’une façon générale et pour un manipulateur droitier, la main droite, qui
maintient dans la zone aseptique l’anse de platine ou la pipette Pasteur, ne doit
pas se déplacer (coude de la main droite sur la paillasse). Tout le matériel
nécessaire : tubes de milieux de cultures, tubes de liquide de dilutions, tubes
stériles ou lames, doit être porté par la main gauche vers la main droite (cf. Fig. 2).
- Flamber, avant et après manipulations, l’anse de platine utilisée pour les
prélèvements, en commençant par chauffer la partie moyenne de l'instrument afin
de dessécher les restes de culture avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci
pour éviter toute projection.
- Prévenir immédiatement le responsable de TP en cas de bris d'un récipient
contenant une culture, en cas de contamination accidentelle d'un manipulateur ou
tout incident dispersant le matériel microbien.
- Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation.
- Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise à l'abri des souches
microbiennes ainsi que leur destruction afin d'éviter toute contamination.
- Vérification avec l’enseignant avant de quitter la salle des robinets d’eau et de
gaz.
7
Flamme bleu
5. Consignes de propreté
Nettoyer les paillasses avec l’eau de Javel à l’aide d’un torchon.
Nettoyer les éviers des colorants et remplir les pissettes d’eau et d’alcool.
Ramener tout le matériel sur les paillasses et ranger le matériel utilisé.
Jeter le verre et le matériel souillé (tubes à usage unique, lames…) dans le bac
d’eau de Javel.
Nettoyer les objectifs du papier joseph et de l’alcool iso-amylique et couvrir les
microscopes et la loupe.
8
Déposer les tubes et les boites de culture ensemencés dans l’étuve ou le
réfrigérateur.
Lavage minutieux des mains.
Le travail est réalisé en position assise ce qui nécessite que tout le matériel soit
disposé à portée de main. L’étudiant doit prévoir tout le matériel nécessaire avant de
commencer la manipulation (tout le matériel doit être accessible sans que l’étudiant
ait à se déplacer ou à être aider par ces collègues). II doit pouvoir manipuler sans
que rien ne s'interpose entre lui et la flamme.
10
8. Ensemencement et mise en culture des bactéries
L’ensemencement est le transport des bactéries dans un milieu de culture neuf et
doit obligatoirement être fait dans des conditions d’asepsie totale. Les cultures sont
faites en milieux liquides (enrichissement) ou en milieux solides (isolement).
Lors d’un diagnostic bactériologique, la mise en culture est toujours nécessaire. Si le
prélèvement provient d’une cavité ouverte et contient par conséquence plusieurs
espèces bactériennes, l’ensemencement sur milieu solide afin d’isoler les bactéries
pathogènes s’avère indispensable. D’ailleurs, c’est à partir de cultures que les divers
caractères biochimiques peuvent être déterminés permettant ainsi l’identification de
ces bactéries.
Sur milieux de culture coulés en tubes, l’ensemencement peut se faire en stries
transversales sur les milieux solidifiés inclinés (stries parallèles et serrées sur la
gélose en pente sans l’érailler) ou en strie médiane (piqure centrale) lorsqu’il s’agit
des milieux en culot (ensemencement en piqûre par le fil en platine ou par une
pipette Pasteur à bout fermé).
11
Fig. 5 : Ensemencement selon la technique des 4 séries de stries.
1. Tracer sur le fond extérieur de la boite de petri deux diamètres
perpendiculaires séparant la boite en quatre secteurs.
2. Prélever à l'anse (stérile) la suspension ou le bouillon dans le cône
stérile.
3. Avec la main gauche saisir la boite (couvercle sur la paillasse) dans le
cône stérile et déposer l’inoculum sur la surface de la gélose, étaler ensuite le
prélèvement par stries très serrées dans une moitié de quadrant (quadrants 1et
2), flamber l'anse et laisser refroidir.
4. Etaler à nouveau le prélèvement par stries moins serrées dans la moitié
correspondante aux quadrants 2 et 3, flamber l'anse et laisser refroidir.
5. Répéter une dernière fois l'étalement en stries encore moins serrées dans
la moitié correspondante aux quadrants 3 et 4.
12
- Toutefois, certains milieux conviennent au développement d'une grande variété de
germes microbiens; le choix de tels milieux repose sur la connaissance de l'habitat
naturel et de la physiologie alimentaire du groupe de germes que l'on désire cultiver.
13
L’effet sélectif est obtenu en jouant sur les facteurs physico-chimiques (tels que
pression osmotique, pH, …) ou par l’action bactériostatique ou bactéricide de
certaines substances telles que : sels minéraux (azide de sodium, tellurite de sodium,
…) ; substances organiques (eau peptonée phéniquée) ; ou des substances
colorantes (vert brillant, vert malachite, cristal violet, …).
Ils sont utilisés pour isoler les germes de produits poly-microbiens. La nature des
inhibiteurs est variable, il peut s'agir :
- de NaCl : milieu de Chapman à 75‰ pour Staphylococcus, bouillon hypersalé à
65‰ pour Enterococcus.
- de sels biliaires (désoxycholate) : Mac Conkey, Hektoen pour Enterobacteriaceae.
- d'antibiotiques: gélose au sang + ANC (acide nalidixique, colistine) pour les
Streptococcus.
- d'antiseptiques : gélose au cétrimide pour Pseudomonas.
14
10. La stérilisation
- La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un
objet, et ce de manière durable.
- En bactériologie, le but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-
organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la
contamination du milieu extérieur et des personnes.
- Il existe deux grands moyens de stérilisation : 1. La chaleur 2. La filtration.
Concernant la stérilisation par la chaleur : la chaleur détruit les bactéries et les
spores. On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».
15
c). Tyndallisation : La tyndallisation est une série de 3 chauffages brefs à des
températures de 70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes
résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant.
16
TP. N° 2. LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE
I. Premières étapes du diagnostic bactériologique (étude des caractères
morphologiques et culturaux)
17
-Examen macroscopique
L’observation de l’aspect macroscopique des colonies sous la loupe binoculaire
permet d’effectuer une première caractérisation, avec une orientation possible des
résultats au cours de l’identification (examen facilité sous différents angles
d’éclairage). Les éléments d’identification macroscopiques sont :
1- La forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.
Allure du contour: bords lisses réguliers ou irréguliers, dentelés, déchiquetés
pouvant même présenter parfois des prolongements (tête de méduse).
Relief: surface bombée, demi-bombée, plate.
Centre: parfois surélève, parfois ombiliquée (en creux).
2- La taille des colonies par la mesure du diamètre : punctiformes ou de taille
mesurable. La taille d’une colonie ne peut être apprécié que si elle est suffisamment
isolée (les colonies serrées les une contre les autres n’atteignent pas leur taille
maximale). Il ne faut pas tout de même oublier que certaines bactéries donnent des
colonies qui s’étalent en vieillissant. Par conséquence, les colonies ne sont
comparables quant à leur taille que dans les zones du milieu de culture présentant
une densité de culture identique.
3- La couleur de la colonie et l’opacité (opaque, translucide ou transparente…). La
transparence des colonies doit être appréciée en lumière naturelle et artificielle.
Certaines colonies élaborent des pigments ce qui représente un élément précieux
d’identification (ex. colonies jaune doré pour Staphylococcus aureus).
4- L’aspect : colonie lisse (S pour smooth), rugueuse (R pour rough) ou muqueuse
(M).
5- l’odeur dégagée par l’ensemble de la culture.
6- l’adhérence appréciée par raclage à l’aide de l’anse de platine.
18
2. Etude des caractères morphologiques (aspect microscopique)
2.1. Etat frais
Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et surtout la mobilité des
bactéries. Il consiste en l’observation d’une goutte de suspension bactérienne,
préparée avec de l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation
se fait sur microscope optique.
(b)
(a)
(c)
19
2.1.2 Observation au microscope
Elle se fait en lumière blanche, éclairage direct de la préparation. Condensateur
baissé si le microscope le permet. Diaphragme fermé (lumière minimale). Objectif x
40 à sec (sans huile). Pour la mise au point, l’objectif est à environ 1 mm au-dessus
de la lamelle.
2.2.1 Technique
-Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche : avec une anse on étale
doucement un peu de suspension bactérienne sur le milieu de la lame.
-Sécher.
-Fixer à l’alcool et rincer à l’eau, ou fixer à la flamme en passant la lame trois fois
dans la flamme du bec Bunsen réglé en flamme éclairante (virole fermée).
-Recouvrir d’une solution de bleu de méthylène pendant une minute.
-Rincer et sécher entre deux papiers-filtres.
-Eliminer l’humidité résiduelle au-dessus de la veilleuse du bec Bunsen.
2.2.2 Observation
Les bactéries sont tuées, fixées sur la lame et colorées. Condensateur monté jusqu’à
la lame si le microscope le permet. Diaphragme ouvert (maximum de lumière).
Objectif x 100 à immersion (avec huile). Pour la mise au point, l’objectif trempe dans
la goutte d’huile. Nettoyer au papier Joseph après utilisation de l’objectif.
20
2.3.1 Technique (cf. Fig. 8)
- Préparer et fixer un frottis bactérien à la chaleur du bec Bunsen.
- Recouvrir au violet de Gentiane (cristal violet) pendant 1min. Eliminer l'excès par
l'eau courante;
- Ajouter du Lugol (mordant) et appliquer pendant 1min, jeter l'excès par l'eau
courante;
- Traiter à l'alcool 95° pendant quelques secondes (10-15 secondes), puis rinçage à
l'eau;
- Recolorer à la Fuschine (safranine) pendant 60 à 75 secondes, rinçage à l'eau puis
séchage.
Les bactéries Gram positif se colorent en violet alors que les Gram négatif se
colorent en rose.
2.3.2 Observation
L'observation se fait en ajoutant de l'huile à immersion et au plus fort grossissement
(grossissement : objectif x 100) en lumière blanche (lumière maximale).
21
TP. N° 3. LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE (suite) :
II. Etude des caractères biochimiques
22
La purification devrait procéder toute identification bactérienne entreprise à partir
d’une colonie isolée.
23
2.1 Test de catalase
C'est une enzyme décomposant l'eau oxygénée en eau et en oxygène gazeux.
H2O2 ½O2 + H2O
La méthode consiste à prélever une colonie du germe à étudier (ex. les
staphylocoques pour les Gram + et les entérobactéries pour les Gram -) sur
l'extrémité d'une anse de platine que l'on plonge ensuite dans une goutte d'eau
oxygénée (à l’aide d’une pipette Pasteur). Le dégagement de bulles gazeuses signe
la présence de l'enzyme (cf. Fig. 9).
24
Fig. 10 : Test d’oxydase.
25
Fig. 11 (a) : Test du nitrate réductase.
26
Fig. 11(b) : Test de nitrate réductase.
27
3. Quelques milieux d’identification (galerie classique)
Les tests biochimiques abordés dans le présent manuel correspondent à la galerie
classique des bactéries Gram négatif. Il est a rappelé que cette liste n’est pas
exhaustif et que elle a été choisi en fonction des tests disponibles au niveau du
laboratoire pédagogique. Compte tenu des changements possibles de la disponibilité
des tests biochimiques au niveau du laboratoire pédagogique, l’enseignant chargé
des travaux pratiques peut développer d’autres tests non abordés dans le présent
manuel ainsi que leur contexte de réalisation (coagulase, lipase, DNase, …).
28
3.1.2 Milieu Kligler Hajna
Le milieu Kligler-Hajna permet de mettre en évidence la production d’H2S
(métabolisme protéique), la recherche de la de la β-galactosidase en 2ème jour et la
fermentation des glucides (glucose et lactose)
C’est un milieu est conditionné en tubes avec une pente et un culot. C’est un milieu
complexe (cf. Tab.1), qui permet la recherche de plusieurs caractères biochimiques.
Il est très utilisé dans l'identification des Enterobacteriaceae. Il est ensemencé de la
manière suivante :
Ensemencer abondamment la surface par stries serrées ou par inondation, puis le
culot par simple piqûre, à l'aide de la même pipette boutonnée (pipette à bout
fermée). Il est important de ne pas oublier de dévisser partiellement la capsule (le
bouchon) afin de permettre les échanges gazeux. Mettre à l'étuve 18-24h à 37°C.
29
Fig. 12 : Test Kligler Hajna.
Tube C : Tube témoin négatif.
Tube n°1 : Bactérie de type oxydatif du glucose ou glucose - et lactose - : culot rouge et pente rouge.
Tube n°2 : Bactérie Glucose, lactose et H2S négatifs.
Tube n°3 : Bactérie de type oxydatif du glucose ou glucose -, lactose - et H2S+ : culot noir et pente rouge.
Tube n°4 : Bactérie de type fermentatif du glucose (+) et lactose + avec production de gaz: culot jaune et
pente jaune.
Tube n°4A : Bactérie de type fermentatif du glucose (+) avec production de gaz et lactose - : culot jaune et
pente rouge.
Tube n°5 : Bactérie de type oxydatif du glucose (+), lactose + sans production de gaz et H2S+ : culot noir et
pente jaune.
30
Si la souche est lactose -, la faible acidité produite sera masquée par l'utilisation des
acides aminés (alcalinisation).
Si la souche est lactose +, il y aura acidification due à l'oxydation du lactose, présent
en quantité importante: virage du rouge de phénol au jaune.
On lit donc le caractère lactose sur la pente.
31
Le test VP est particulièrement intéressant pour caractériser le groupe Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia et Serratia (complexe KEHS cf. cours des entérobactéries).
32
Fig. 14 : Test du citrate de Simmons.
3.1.5 Mannitol-Mobilité
Ce milieu permet l’étude de la fermentation du mannitol (caractère biochimique) et la
mobilité de la souche (caractère morphologique). Ce milieu est utilisable uniquement
pour les bactéries fermentatives. La présence d’une faible teneur d’agar (gélose
molle) rend possible le déplacement des bactéries mobiles autour de la piqûre
centrale (le milieu est ensemencé à l’aide d’un fil de platine ou une pipette Pasteur à
bout fermée et incubé à 37°C pendant 18-24 heures). La lecture de l’utilisation du
mannitol est possible grâce à la présence d’un indicateur de pH, le rouge de phénol.
L’utilisation du mannitol acidifie le milieu qui peut ainsi être révélé par le virage de
l’indicateur de pH à sa teinte acide (jaune).
33
Les bactéries mobiles diffusent à partir de la ligne d’ensemencement, créant un
trouble dans le milieu alors que les bactéries immobiles poussent uniquement le long
de la strie d’ensemencement. La présence de nitrate de potassium permet aussi la
recherche du nitrate réductase grâce à ce milieu (en ajoutant à la surface, les réactifs
de Griess (nitrite 1 et nitrite 2) (cf. test du nitrate réductase).
34
Lorsqu’une suspension bactérienne de densité convenable est répartie dans les
différentes alvéoles qui composent la microgalerie (contenant de substrats
déshydratés), les métabolites produits durant la période d’incubation se traduisent
par des changements de couleur spontanés ou révélés par addition de réactifs.
Elle comprend généralement 20 tests biochimiques.
La première galerie qui a été utilisée est la galerie Api 20 E (Fig. 16), destinée à
l’identification des entérobactéries. Actuellement dans le laboratoire de bactériologie
médicale de l’Institut des Sciences Vétérinaires, seules les galeries Api 20 E, Api 20
NE, Api Staph et Api 20 Strep sont disponibles.
35
-Pour la galerie Api 20 E, les entérobactéries (bacilles Gram négatif, peu exigeants et
oxydase négatif) sont facilement identifiées par le biais de cette galerie. Les
Vibrionaceae, Pseudomonas et les Aeromonodaceae sont également d’identification
possible avec cette galerie.
36
Fig. 17 : Préparation de la suspension bactérienne et ensemencement de la
galerie Api 20 E.
37
4.3 Lecture et interprétation des résultats
Pour la lecture, il convient de regarder si la réaction est positive ou négative
séparément pour chacun des tests. La révélation est permise par la présence
d’indicateurs colorés dans les substrats. Un changement de couleur du milieu dans le
tube, signifie généralement que le test est positif. Il faut tout de même ne pas oublier
que certains tests nécessitent l’addition de réactifs.
Un tableau des caractères à vérifier pour chaque milieu est fourni par le fabriquant
afin de permettre l’interprétation des résultats.
Concernant l’interprétation des résultats, les tests sont regroupés par triplet de
gauche à droite. Un test négatif vaut toujours 0. La valeur des tests positifs, quant à
elle, est différente selon la position du test dans le triplet. Dans chacun d’eux, si le
premier test est positif, il vaut 1, si c’est le deuxième, 2, et si c’est le troisième, 4. Il
faut ensuite additionner les trois valeurs obtenues pour obtenir le code du triplet
(seules huit valeurs, de 0 à 7, sont possibles). Un code à sept chiffres est obtenu par
lecture des codes des triplets de gauche à droite. Ce code, comparé à ceux
référencés dans la base de données gérée par le fabricant, permet l’identification de
la bactérie.
38
Tab. 2 : Tableau de lecture de la galerie Api 20 E.
Lecture directe ou
Caractère Résultat
Microtube Substrat indirecte (Test si Résultat +
recherché -
nécessaire)
ONPG Ortho-Nitro- β- Lecture directe
Phényl- galactosidase
Galactoside
-
NO / N Nitrates Nitrate Lecture indirecte
2 2 (NO3) réductase dans la cupule GLU
Test : ajouter 1
goutte de réactif de
Griess
Ajouter de la poudre
zinc en cas de
résultat négatif
39
Avec le tableau d’identification : comparer les réactions notées sur la fiche de
résultats avec celle du tableau : chaque cellule de ce tableau contient les
pourcentages de positivité • Avec le catalogue analytique : Les tests sont regroupés
en groupe de 3, et une valeur (1, 2 ou 4) est indiquée pour chacun.
Additionner à l’intérieur de chaque groupe les nombres correspondants aux tests
positifs. On obtient un nombre à 7 chiffres qui sert de code d’identification
40
TP. N° 4. ANTIBIOGRAMME
Objectif :
L’antibiogramme a pour but de mettre en évidence les effets des antibiotiques sur les
bactéries isolées au niveau du laboratoire. Elle permettra de répondre aux
hypothèses suivantes :
-Les antibiotiques agissent de manière inégale sur un même type de bactérie.
-Touts les antibiotiques ne fonctionnent pas sur toutes les bactéries.
Il est fondamental de mesurer l’activité des antibiotiques :
- pour sélectionner, in vitro, le ou les antibiotiques actifs sur une bactérie
identifiée ou non ;
- Pour agir vite et éviter la prolifération microbienne et la septicémie.
1. Définition
L’antibiogramme standard est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un ou
plusieurs antibiotiques. L’identification bactérienne devra donc souvent être
complétée par l’antibiogramme (standard). En effet, l'antibiogramme vise à trouver
l'antibiotique le plus efficace sur les bactéries prélevées en cas d’infection
bactérienne, d’exploitées les données pour la surveillance des résistances
bactériennes aux antibiotiques (échange de données par le logiciel WHONET fourni
par l’OMS) et une indication supplémentaire pour l’identification du germe par la mise
en évidence de résistances naturelles.
L’antibiogramme d’une souche peut être déterminé en milieu liquide par la méthode
de la CMI (concentration minimale inhibitrice) ou par la technique des disques.
Il existe aussi des galeries d’antibiogramme qui permettent la catégorisation de la
souche bactérienne à tester par rapport à plusieurs antibiotiques sur les CMI déjà
fixées. Des méthodes dites automatisées permettant l’obtention rapide des résultats
et la reproductibilité des tests ont été récemment développées. Les automates
fonctionnent de la même manière que les galeries mais permettent de tester
plusieurs concentrations d’antibiotiques.
Un antibiogramme doit obligatoirement être effectué sur une culture pure et
identifiée. Cela permet d'ajuster la densité de l'inoculum, de choisir judicieusement
les antibiotiques à tester, et de pratiquer une lecture interprétative.
41
1.1 Limites de l’antibiogramme
L’antibiogramme est réalisé in vitro, tandis qu’une infection bactérienne à plusieurs
composantes qui varient avec le temps : la localisation de l’infection, l’animale, les
concentrations d’antibiotiques et les bactéries. Ainsi, l’antibiogramme ne peut pas
prédire le comportement des antibiotiques in vivo :
-Diffusion au site de l’infection ;
-Choix de posologie ;
-Pénétration dans les cellules ;
-Influence des facteurs physiologiques ou pathologiques ;
-Transformation de la molécule d’antibiotique in vivo ;
-Emergence d'une résistance au cours du traitement ;
-Etat physiologique de la bactérie au sein du foyer infectieux (les bactéries «au
repos» sont insensibles aux antibiotiques qui interfèrent avec la biosynthèse du
peptidoglycane et de même pour les mutants dépourvus de paroi).
42
2.2 Préparation de l’inoculum
Cette méthode consiste à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de
concentrations croissantes d'antibiotiques. C’est la méthode de référence (dilution en
milieu liquide ou solide). En revanche, elle est fastidieuse et lente.
En milieu liquide, l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode
de macrodilution) (cf. Fig. 21) ou de cupules (méthode de microdilution).
CMI
43
Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus
faible concentration d'antibiotique où aucune croissance n'est visible (cf. Fig. 22).
Dans la Fig. 22, la CMI de la souche testée est de 2 μg/mL (premier tube dans lequel
aucune croissance n'est visible à l'œil nu).
La méthode par dilution peut aussi être réalisée en milieu solide ou l'antibiotique est
incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Petri. La surface de la gélose est
ensemencée avec un inoculum des souches à étudier (cf. Fig. 23). Après incubation,
la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu
contenant la plus faible concentration d'antibiotique.
Elle permet également de mesurer la concentration inhibitrice 99% (concentration qui
inhibe la croissance de 99% des cellules d'une souche bactérienne=CMI) ou la
concentration inhibitrice 50% (concentration qui inhibe la croissance de 50% des
cellules d'une souche bactérienne).
44
Néanmoins, cette technique s'applique mal à l'évaluation de la sensibilité à des
antibiotiques qui diffusent peu dans la gélose (polymyxines ou glycopeptides) et
toute résistance devrait être confirmée par la mesure de la CMI (antibiogramme par
dilution).
L’antibiogramme par diffusion est inadapté pour des bactéries telles que les
mycoplasmes par exemple ; en raison de la petite taille des colonies et de la durée
d'incubation souvent longue. De même, pour les bactéries intracellulaires obligatoires
(Chlamydia, Rickettsia...), l'étude de leur sensibilité aux antibiotiques nécessite le
recours à des techniques particulières rarement effectuées en routine.
45
Fig. 24: Etalon de Mc Farland servent de standard de turbidité pour préparer les
suspensions bactériennes.
Pour effectuer cet ajustement de turbidité, on peut utiliser un appareil photométrique
(densitomètre) ou la comparaison visuelle. La méthode visuelle consiste à comparer
visuellement le bouillon de culture en phase de croissance et le tube étalon en les
plaçant devant une série de lignes noires sur un fond blanc en présence d’une
source de lumière adéquate (cf. Fig. 24).
L’inoculum bactérien devrait être ensemencé au cours des 15 minutes qui suivent
l’ajustement de sa turbidité.
Cette méthode convient pour toutes les bactéries y compris à croissance lente dont :
Haemophilus spp., Streptococcus pneumoniae, les streptocoques β hémolytiques.
Remarque : il y a possibilité de réalisation d’un antibiogramme direct sur la primo-
culture sans repiquage pour les prélèvements (LCR, Hémoculture..) réalisés dans
des situations d’urgence.
46
Les disques sont présentés en cartouche de 50 disques conditionnés en containers
étanches contenant un dessicant (agent desséchant). La date de péremption et le
numéro de lot figurent sur chaque conditionnement (cartouche et container).
Le choix des antibiotiques dépend de la souche bactérienne à tester tout en tenant
compte des résistances naturelles
Ainsi pour les Aminosides par exemple, l’existence de nombreuses transférases
différentes capables d’inhiber seulement quelques antibiotiques de la famille, impose
de tester plusieurs antibiotiques.
Pour les Macrolides, il faut toujours employer 2 disques de Macrolides, dont l’un doit
impérativement être l’Erythromycine pour apprécier la résistance MLS (Macrolides,
Lincosamides et Streptogramines) chez des bactéries de type staphylocoques et
streptocoques.
De plus, la résistance étant inductible, il faut par conséquence lire l’antibiogramme au
bout de 24 heures car à 18 heures, la bactérie peut apparaitre faussement sensible.
Pour les Bêtalactamines, le choix de l’Amplcilline intéressant pour les bactéries Gram
négatif, est inutile et même nuisible pour les staphylocoques, car l’Ampicilline est un
moins bon inducteur des β-lactamases que la pénicilline elle-même.
Pour les staphylocoques, il faut tester la Méthicilline.
47
La gélose MH-F additionnée de 5% de sang de cheval défibriné mécaniquement et
de 20 mg/L de β-NAD, est employée pour Streptococcus spp. dont Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus spp., Pasteurella multocida, … et autres bactéries à
croissance lente.
Conserver les boîtes préparées au laboratoire à 8-10°C. Si elles sont conservées au-
delà de 7 jours, les conserver à 4-8°C en sachet plastique scellé.
48
3.4.3 Application des disques
Laisser réchauffer les disques à la température de la pièce (environ 1 à 2 heures)
avant de les utiliser.
Répartir les disques uniformément sur la gélose: généralement ≤ 12 disques pour la
boite de Petri de 150 mm de diamètre ou ≤ 5 disques/boite de Petri de 100 mm sauf
exception (p. ex., pneumocoque ≤ 9 disques pour la boite de Petri de 150 mm de
diamètre ou ≤ 4 disques pour la boite de Petri de 100 mm de diamètre).
En général, pour la boite de 90 mm de Diamètre, on n’utilise pas plus de 6 disques.
Les disques doivent être espacés minimum de 24 mm centre à centre.
Enfin les disques d’antibiotiques doivent être appliqués sur la gélose en pressant
chaque disque à l’aide de pinces bactériologiques stériles pour s’assurer de leur
application et ils ne doivent pas être déplacés même si mal placés car, la diffusion
des antibiotiques est très rapide. Il existe éventuellement des distributeurs
automatiques des disques d’antibiotiques.
Dès lors que l’emballage a été ouvert, les disques doivent toujours être réfrigérés
s’ils ne sont pas utilisés. Éviter de les laisser plusieurs heures à la température de la
pièce. Une cartouche ouverte doit être utilisée dans un délai de 5 jours qui suivent
l’ouverture.
Les disques d’antibiotiques doivent être conservés selon la nature des antibiotiques
comme suit :
- Congélateur avec givre à ≤ -14°C, avec dessiccateur;
- Réfrigérateur à 2-8°C, avec dessiccateur ;
- Antibiotiques thermolabiles (≤ 1 sem.) : réfrigérateur à 2-8°C, avec dessiccateur.
49
3.5 Lecture et interprétation
La croissance se traduira par l’apparition d’une nappe à la surface de la gélose sauf
aux endroits où ont été déposés les disques d’antibiotiques auxquels la souche est
sensible (cf. Fig. 25). Si la souche est sensible à un antibiotique, il y aura une zone
d’inhibition autour du disque (appelée plage de lyse ou zone d’inhibition) (cf. Fig. 26
et 27).
Les zones d’inhibitions doivent êtres mesurées au millimètre le plus proche à l’aide
d’un pied à coulisse appliqué sur le fond de la boîte de Petri fermée (ou un compas
appliqué en contact de la gélose) et comparées avec les valeurs critiques. Les
diamètres des zones d’inhibition peuvent être mesurés avec une règle (cf. Fig. 26) ou
encore un système de lecture automatisé.
La lecture se fait en déposant la boîte sur un fond noir et en utilisant une lumière
réfléchie. Il faut s’assurer que tous les étudiants respectent les mêmes critères.
La lecture du même test doit être faite par plusieurs étudiants : variation maximale de
± 2 mm d’un lecteur à un autre puis validation du résultat.
50
Fig. 26 : Lecture de l’antibiogramme par diffusion.
51
Les diamètres des zones d’inhibition mesurés seront comparés aux diamètres
critiques donnés par les instances en vigueur (Réseau Algérien de la Surveillance de
la Résistance des Bactéries aux Antibiotiques : RASRBA et Clinical Laboratory
Standards Institute : CLSI) afin de classer la bactérie dans l’une des catégories
Résistant, Intermédiaire, Sensible.
Les résultats d’un antibiogramme sera réalisé en reportant les diamètres d’inhibition
mesurés ∅ pour chaque antibiotique et les diamètres critiques dans un tableau (Tab.
3). Une colonne permettra d’interpréter la résistance ou la sensibilité de la souche
pour chaque antibiotique.
On peut en déduire (Tab. 3) si une bactérie est résistante (R), intermédiaire (I) ou
sensible (S) à un antibiotique, et donc adapter l'antibiothérapie, pour proposer au
patient l'antibiotique le plus efficace pour son infection.
• Les souches catégorisées S (souches sensibles) sont celles pour lesquelles la
probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d’un traitement par voie
systémique (générale ou orale) avec la posologie recommandée : CMI < ou égale à
la concentration critique basse.
• Les souches catégorisées R (souches résistantes) sont celles pour lesquelles il
existe une forte probabilité d’échec thérapeutique quels que soient le type de
traitement et la dose d’antibiotique utilisée : CMI > à la concentration critique haute.
• Les souches catégorisées I (souches de sensibilité intermédiaire) sont celles pour
lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible.
52
Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in
vitro ne sont pas prédictifs d’un succès thérapeutique.
En Zone intermédiaire, l'efficacité de l'antibiotique sur la bactérie n'est pas sûre. Il
vaut mieux alors prendre un autre antibiotique, auquel la bactérie est sensible.
Les souches catégorisées I sont celles pour lesquelles la CMI mesurée (ou le
diamètre) est supérieure à la concentration critique basse et inférieure ou égale à la
concentration critique haute (raisonnement identique pour les diamètres vis-à-vis des
diamètres critiques correspondants). La probabilité de succès thérapeutique est forte
uniquement dans le cas d’un traitement par voie systémique avec une posologie
forte ou lorsque l’antibiotique se concentre au site de l’infection (voie locale).
Pour une information complète des prescripteurs, cette catégorie intermédiaire va
devenir « sensible à forte posologie ».
Pour certains antibiotiques il n’y a qu’une seule concentration critique, donc il n’existe
pas de catégorie intermédiaire. En cas de sensibilité (CMI mesurée inférieure à la
concentration critique), il convient de suivre attentivement les recommandations, car,
dans certains cas, seule la forte posologie est recommandée.
4. E-test
La commercialisation d'une technique rapide et simple, le E-test permet à un
laboratoire une estimation indirecte de la CMI.
Le Etest®, technique en milieu gélosé, permet de déterminer la CMI grâce à
l'utilisation de bandelettes imprégnées d'un gradient exponentiel continu de
l'antibiotique à tester.
Le principe du Etest® est basé sur l’association des caractéristiques des méthodes
de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes (supports inertes,
hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont appliquées sur la
surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un inoculum de la souche
à étudier.
Après incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d'inhibition
dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI (cf. Fig. 28).
Une échelle de lecture, imprimé sur la bandelette, permet une interprétation rapide.
53
Fig. 28 : Détermination de la CMI par le E-test.
5. Association d’antibiotiques
L'interaction de deux antibiotiques (A et B) peut produire quatre principaux effets :
• effet synergique : l'effet de l'association est supérieur à la somme des effets
produits par chacun des antibiotiques pris isolément. L’effet (A+B) > effet A + effet B ;
• effet additif : l'effet de l'association est légèrement supérieur à la somme des effets
produits par chacun des antibiotiques pris isolément. L’effet (A+B) = effet A + effet B ;
• effet indifférent : l'activité d'un antibiotique n'a aucune influence sur l'activité de
l'autre. L’effet (A+B) = effet A ou effet B ;
• effet antagoniste : l'effet de l'association est inférieur à la somme des effets produits
par chacun des antibiotiques pris isolément. L’effet (A+B) < effet A ou effet B.
54
Fig. 29 : Test de synergie positif (aspect en bouchant de champagne).
55
REFERENCES
-Anonyme 1 (2014) : Croissance des bactéries. Collégiale des enseignants de
bactériologie-virologie-hygiène, Université Médicale Virtuelle Francophone.
-Bent Mohamed A., Mint Sidi Baba A. (2007-2008) : manuel de travaux pratiques de
microbiologie, Université de Nouakchott, 27 pages.
-Kayser F.H., Böttger E. C., Deplazes P., Haller O. et Roer A. (2008) : Manuel de
poche de microbiologie médicale 2ème édition Médecine Sciences Flammarion,
France, 764 pages.
56