Université Saad Dahleb, Blida

Faculté des Sciences Agro-Vétérinaires

Département de Biologie

Compte rendu du TP Nº 03 de microbiologie

Qu’est qu’un milieu de culture ?

Les différents types de milieux de culture.

Examen macroscopique.

Les techniques d’isolement.

Année scolaire : 2008 /2009

* Pour un diagnostic bactérien, on prélève du patient un prélèvement a fin de trouver l’agent
causal de la maladie, puis on fait un isolement des bactéries (sépare les bactéries du reste de
l’échantillon) qu’on souhaite traiter cet isolement exige l’utilisation des milieux de culture.
Qu’est qu’un milieu de culture  ?

C’est un support pour les bactéries, qui contient des éléments nutritifs indispensables à la
croissance et la survie des bactéries. Les éléments nutritifs abandons dans les milieux sont :
 Des ions métalliques : phosphore, azote, soufre et des ions en traces : magnésium,
cuivre…etc.
 Source d’énergie :le glucose comme source de carbone.
 L’eau.
 Tampon pH(règle le pH adéquat pour le développement de la bactérie,généralement
l’optimum de croissance des bactéries est de 7 ).
 Parfois on trouve des facteurs de croissance tel que des vitamines , chocolat ,œuf .

Les ingrédients apportés au milieu de culture dépendent des exigences et besoins nutritifs de
chaque espèce bactrienne ce qui explique les différents types de milieux de cultures.

Les différents types de milieu de culture selon leur composition  :

1. Milieu synthétique  :
Préparés exclusivement avec des produits chimiques purs. Le milieu synthétique de
composition bien définie, constitue le milieu de culture idéal. Ce type de milieu permet
d'obtenir des résultats comparables et de déceler avec précision les modifications qu'il subit au
cours du développement microbien. Il n'en est généralement pas de même avec les milieux
non synthétiques qui sont constitués par des éléments complexes de composition variable. Les
milieux synthétiques conviennent surtout aux moisissures (champignons microscopiques)
mais fort peu aux bactéries.

2. Milieu complexe  :
Milieu dont on ne connaît que partiellement la composition. Ces milieux de culture peuvent
contenir des extraits de levure (cellule de levure déshydratée et lysées) qui fournissent une
source d'acide aminé de vitamine et d'azote, des extraits de malt apportant une source de
carbone, des peptones (protéine animale, de poisson, de caséine de lait) source d'azote
organique qui intéresse les individus hétérotrophes. (Ex. bouillon nutritif, bouillon au soja.).

Et on a plusieurs types :
 Milieu simple ou général  :
Les composants chimiques +gélose (sucre ajouté a un solidifient). Le milieu simple, c’est un
milieu minimal +gélose.
 Milieu enrichi  :
C’est un milieu simple +des facteurs de croissance (œuf, vitamines, chocolat, extrait de
viande…etc.).Ce milieu sert au développement de certaines bactéries auxotrophes qui
nécessitent des facteurs de croissance.
 Milieu sélectif  :
Favorise le développement d’une espèce bactérienne -permet de sélectionner un type
bactérien parmi plusieurs- et inhibe les autres bactéries, ce milieu contient des facteurs
inhibiteurs comme l’antibiotique, poison ou des colorants comme la fuchsine. La gélose
macConky est utilisée pour détecter E.coli et d’autres bactéries apparentées. Les sels
biliaires ou les colorants comme le Crystal violet et le rouge neutre favorise la croissance
des bactéries gram-négatifs et inhibe celle des bactéries gram-positifs.
La gélose Chapman est un milieu sélectif a gram positif.
 Milieu spécifique  :
C’est un milieu d’identification de la bactérie, ce milieu donne l’exactitude de la bactérie déjà
isolée.
Différentiation des colonies bactériennes (examen macroscopique) :
Sur ces milieux de culture une cellule bactrienne nous donne des millions de descendants
s’accumulent sous une masse appelée «colonie », on a deux types de colonies : une colonie
pur qui contient la même espèce,et une colonie mixe ou poly microbienne qui contient deux
ou plusieurs types de bactéries.
Après isolement et incubation on effectue un examen macroscopique qui constitue a
différentier les bactéries selon la taille, la couleur, la forme : lisse, irrégulière ou bien bombés
ou plate.

EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES

L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de
l'isolement après incubation. L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé de la durée et de la
température de l'incubation.
Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : les
colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées. La colonie peut apparaître à la
surface du milieu de culture pour les germes aérobies, ou être en profondeur pour les germes
anaérobies

1. Aspect de colonies en surface sur milieu solide

1.1. La taille
Elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies. Il est possible
aussi d'utiliser le microscope au grossissement le plus faible pour mesurer la taille des petites
colonies en utilisant de micromètres oculaires.
. 1.2. La forme
 Allure de contours : lisse, dentelés, déchiquetés, irréguliers
 Relief : surface bombée, demi-bombée, plate.
 Centre : parfois surélève, parfois ombiliquée (en creux)

1.3. L'aspect de la surface

La surface d’une colonie bactérienne peut être lisse, rugueux, renvoyer la lumière de façon à
leur donner un reflet métallique ou un aspect irisé.

1.4. La consistance
Au moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses, crémeuses
(on obtient facilement des suspensions homogènes), sèches ou encore muqueuses (on obtient
difficilement des suspensions homogènes).
1.5. La couleur et/ou pigment
Plusieurs colonies n’ont pas une couleur bien définie (blanc, gris). Par contre, certaines
bactéries produisent un pigment insoluble qui donnent un aspect bien caractéristique à la
colonie (rose, jaune, rouge …), tendis que d’autres produisent un pigment soluble qui diffuse
et colore le milieu
2. Aspect de la pousse en milieu liquide
Les bouillons nutritifs sont aussi utilisés pour cultiver les bactéries. Dans un bouillon la
croissance microbienne se traduit par l’apparition d’un trouble ou opalescence mais l’aspect
varie selon les espèces.
3. Mode opératoire :
a. Milieu solide:
 Repiquer différentes aspects et formes de colonies sur des tubes de gélose linéaire
 Incuber à 37°C pendant 24 h
 Observer) les différents aspects

1b. Milieu liquide :

 Repiquer à l’aide d’une anse de platine des colonies différentes dans des tubes de
bouillon nutritifs
 Flamber l’anse après chaque repiquage
 Incuber à 37 °C pendant 24 à 48h
 Observer les différents aspects de pousse en milieu liquide

Techniques d’isolement  :

Isoler la bactérie c’est la séparer du reste du prélèvement, puis on purifie (une série des
ensemencement pour avoir une colonie pur )les bactéries au fur et à mesure des
ensemencements, c’est le point de départ d’une étude aboutissant à l’identification.
On peut isoler les bactéries par la méthode des quadras (épuisement du milieu) ou par
épuisement simple.