1.techniques Immunologiques (Cours)

Techniques immunologiques faculté de médecine de Sidi Bel Abbes 2021-2022
Techniques immunologiques
Table des matières
Introduction ......................................................................................................... 2
A-Méthodes n’utilisant pas de marqueurs........................................................ 3
I. Techniques d’immunoprécipitation..................................................................................... 3
I.1 Techniques de précipitation en milieu liquide ............................................................... 3
1) Technique de l’anneau = Ring test.............................................................................. 3
2) Néphélométrie / turbidimétrie LASER ....................................................................... 4
I.2 Techniques de précipitation en milieu semi-solide ....................................................... 4
1) Immunodiffusion double d’Ouchterlony .................................................................... 4
2) Electrosynérèse = Contre-immunoélectrophorèse ...................................................... 5
3) Immuno-diffusion radiale de Mancini ........................................................................ 6
4) Electroimmuno-diffusion ............................................................................................ 6
5) Immunoélectrophorèse ................................................................................................ 6
6) Immunofixation........................................................................................................... 7
7) Immuno-sélection ....................................................................................................... 8
a) Immuno-sélection en IEP ........................................................................................ 8
b) Rocket immuno-selection......................................................................................... 8
II. Techniques d’immuno-agglutination ................................................................................. 9
II.1 Paramètres intervenant dans l’agglutination ................................................................ 9
II.2 Types d’agglutination immunologique ........................................................................ 9
1) Agglutination directe ou active ................................................................................... 9
2) Agglutination indirecte ou passive ............................................................................ 10
B-Méthodes utilisant un marqueur ................................................................. 11
I. Techniques d’immunofluorescence ................................................................................... 11
I.1 Réactions d’Immunofluorescence Directe (IFD)......................................................... 12
I.2 Réactions d’Immunofluorescence Indirecte (IFI) ........................................................ 12
II. Techniques immuno-enzymatiques ................................................................................. 12
III. Techniques radio-immunologiques ................................................................................ 14
III.1. Radio-Immuno-Dosage par Compétition ................................................................. 14
III.2 Radio-Immuno-Dosage Sans Compétition ............................................................... 15
Dr ZEGHICHI C Page 1
Introduction
Afin de quantifier et/ou de détecter la présence d’un Ag et/ou d’un Ac une variété de techniques
immunologiques existe. Elles sont utilisées pour :
1. le diagnostic des maladies : maladies auto-immunes, allergiques ou infectieuses
2. le contrôle du niveau d’une réponse immunitaire humorale : post-infectieuse, post-
vaccinale ou post-transplantation.
3. et pour l’identification de molécules d’intérêt biologique ou médicale.
Ces techniques diffèrent entre elles par leur rapidité et leur sensibilité, leur caractère qualitatif
ou quantitatif.
Toutes les techniques immunologiques sont basées sur la formation des complexes immuns Ag-
Ac grâce à une interaction entre une partie de l’Ac appelée paratope et une partie de l’Ag
appelée épitope.
paratope
Selon la méthode de révélation de ces complexes on distingue plusieurs techniques :

➢ Méthodes n’utilisant pas de marqueurs
Dans ces techniques les complexes immuns sont visualisés directement sous forme de
❖ précipité : techniques d’immuno-précipitation
❖ ou d’agglutinat : techniques d’immuno-agglutination
➢ Méthodes utilisant un marqueur

Les complexes immuns sont détectés par l’addition de substances radioactives, fluorescentes,
ou une enzyme appelées marqueur.
A-Méthodes n’utilisant pas de marqueurs

I. Techniques d’immunoprécipitation
Elles sont basées sur la formation d’un réseau Ag-Ac ou précipité
immun lors de la rencontre des Ac avec des Ag moléculaires solubles.
Conditions nécessaires pour la formation du précipité :
✓ L’Ag doit être soluble et multivalent : offre au moins 2 épitopes* (Protéine,
Polysaccharide de haut poids moléculaire).
✓ L’Ac doit réagir avec au moins 2 sites de fixation (paratopes) (IgG +++, rarement IgM
et IgA).
✓ Les concentrations de l’Ag et de l’Ac doivent être dans la zone d’équivalence : zone
à laquelle les quantités de l’Ag et de l’Ac sont équivalentes ce qui permet la formation
d’un complexe immun Ag-Ac sous forme d’un réseau grand et stable.
En présence d’un excès d’Ac ou un excès d’Ag les complexes immuns formés sont de
petite taille et ne peuvent pas former un réseau.
Il existe des réactions de précipitation en milieu liquide et des réactions en milieu semi-solide.
I.1 Techniques de précipitation en milieu liquide

1) Technique de l’anneau = Ring test
Basée sur la formation d’un précipité à l’interface d’une solution
d’un Ac et celle de son Ag spécifique.
Elle permet la détection et le titrage grossier d’anticorps dans un
sérum. Mais elle est peu performante car l’anneau est d’apparition
transitoire.
2) Néphélométrie / turbidimétrie LASER

➢ Néphélométrie
Un rayon LASER traverse la cuve contenant d’éventuelles particules du précipité Ac/Ag. Ces
particules induisent une diffraction de la lumière, elle est mesurée à la sortie par un
photomultiplicateur (détecteur). L’intensité de la lumière diffractée est proportionnelle à la
quantité des CI formés et donc à la concentration de la substance à doser.
➢ Turbidimétrie
Dans ce cas on mesure l’intensité de la lumière transmise transversale. Elle est inversement
proportionnelle à la quantité des CI formés.
La mesure est très sensible, rapide et automatisée, permet un dosage quantitatif.
Utilisée pour le dosage des protéines dans différents liquides biologiques : les
immunoglobulines, les chaines légères libres, les fractions du complément, protéines de
l’inflammation (la CRP, l’Haptoglobine, le fibrinogène, l’orosomucoïde, la
transferrine…)……
I.2 Techniques de précipitation en milieu semi-solide

Elles se font sur gel d’agarose 2-3%.
1) Immunodiffusion double d’Ouchterlony
L’Ac et l’Ag diffusent radialement l’un vers l’autre à partir de puits creusés dans de l’agar,
leurs concentrations diminuent progressivement en s’éloignant des puits. Quand l’équivalence
est atteinte, une ligne blanchâtre visible à l’œil nu se forme (en 1 à 2 jours).
Un ou plusieurs Ag inconnus et un Ag inconnu sont placés chacun dans un puits autour d’un
puits central contenant un Ac dirigé contre l’Ag connu. L’aspect des lignes de précipitation
obtenues varie en fonction d’identité (de ressemblance) entre les différents Ag.
Principales applications en immunochimie

➢ Comparaison entre 2 ou plusieurs antigènes
➢ Recherche et identification de la protenurie de Bense Jones (PBJ) dans les urines.
➢ Contrôle de pureté d’une substance antigénique.
Mais elle est qualitative et parfois difficile à interpréter.
2) Electrosynérèse = Contre-immunoélectrophorèse
Elle est basée sur le même principe que l’IDD
d’Ouchterlony en appliquant un champ électrique. Ce
qui permet d’accélérer la diffusion et d’augmenter la
sensibilité.
Elle est utilisée pour la recherche des anticorps appelés précipitines pour le diagnostic des
alvéolites allergiques extrinsèques (sérologie aviaire).
3) Immuno-diffusion radiale de Mancini

- L’échantillon d’un Ag connu est placé dans un puits et diffuse (pendant 2-10jours) dans
de l’agar contenant une dilution donnée d’un Ac.
- un précipitation visible se produit dans la zone d’équivalence sous forme d’anneaux dont
le diamètre est proportionnel à la concentration.
Elle est longue (48H) et peu sensible non adaptée aux faibles concentrations.
4) Electroimmuno-diffusion
Même principe que la technique de Mancini avec application d’un champ électrique.
Formation de fusées ou de Rockets dont la hauteur est proportionnelle à la concentration.
❑ Application en immuno-chimie
Dosage des antigènes connus exemple : Immunoglobulines (de plus en plus remplacée par la
néphélémétrie laser).
5) Immunoélectrophorèse
Elle combine une électrophorèse et une immunodiffusion double :
➢ Electrophorèse : séparation des constituants d’un mélange d’Ag selon leur charge
électrique et leurs poids moléculaires.
➢ Immunodiffusion : dépôt des immuns sérums dans la gouttière centrale, diffusion de
l’Ac et l’Ag l’un vers l’autre et formations de lignes de précipitation dans la zone
d’équivalence.
C’est une technique qualitative et semi-quantitative avec une sensibilité de 150 mg/l, mais elle
est longue (au moins 3 jours) et son interprétation est parfois difficile.
Cette technique est utilisée pour le dépistage et l’identification de l’isotype du composant
monoclonale dans les immunoglobulinopathies monoclonales.
6) Immunofixation
Technique en 2 temps :
➢ Dans un 1er temps : Electrophorèse
On réalise autant de migrations du sérum que d’antisérum à tester dans la 2ème étape (6 pistes
dans l’IFx standard).
➢ Dans un 2ème temps : Diffusion des immun-sérums monospécifiques (anti-chaînes
lourdes et légères).
C’est une technique qualitative pure. Elle est plus sensible, plus rapide (2H) et son interprétation
est plus aisée que l’mmunoélectrophorèse.
Principale application en immuno-chimie

Dépistage et identification de l’isotype du composant monoclonale dans les
immunoglobulinopathies monoclonales.
7) Immuno-sélection
La maladie des chaînes lourdes alpha (lymphome méditerranéen) est caractérisée par la
production de chaînes lourdes non associées aux chaînes légères et sont mélangées aux IgA
polyclonales dans le sérum ce qui impose leur sélection.
2 techniques sont utilisées :
a) Immuno-sélection en IEP
• Dans un 1er temps: Electrophorèse au sein du gel incorporé d’anti-K et anti-λ
Précipitation des toutes les Ig entières du sérum s/f d’obus.
• Dans un 2ème temps : l’ajout de l’anti-IgA et sa diffusion entraîne la précipitation des

chaines lourdes alpha non précipitées précédemment, sous forme d’une ligne de
migration anodique, traversant l’obus.
b) Rocket immuno-selection
Même principe que l’IS en IEP + champs électrique.
Plus sensible, Plus rapide.
Utilisation d’un Témoin +.
II. Techniques d’immuno-agglutination

Elles sont caractérisées par la formation d'un complexe immun entre des antigènes
particulaires (bactérie, globule rouge, particules de latex recouvertes d’Ag…) et les anticorps
spécifiques agglutinants.
Ce complexe immun est visible à l'œil nu ou au microscope à faible grossissement sous forme
d'amas.
II.1 Paramètres intervenant dans l’agglutination

1. Nombre de sites à la surface de la particule
L’Ag doit porter au moins deux épitoes.
2. Influence de la température :
La température est directement liée à l’isotype de l’Ac étudié :
▪ IgM = Ac à optimum thermique froid : Ac froids (4°C)
▪ IgG = Ac à optimum thermique chaud : Ac chauds (37°C)
3. PH : neutre
4. Concentrations de l’Ag et de l’Ac
Phénomène de prozone c’est l’absence d’agglutination à forte concentrations d’Ac : le nombre
de sites de liaison de l’Ac peut excéder celui des épitopes antigéniques. Les Ac ne se lient à
l’Ag que d’une façon univalente, Il n’y a donc pas de formation de l’agglutination. Le même
phénomène de prozone se produit également en excès d’Ag.
II.2 Types d’agglutination immunologique

1) Agglutination directe ou active
L’Ag est un composant intrinsèque de la particule. On cherche son anticorps spécifique dans
un liquide biologique (sérum, urine….).
Cette méthode est largement appliquée pour :

1. La détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus (la particule est un globule
rouge= hémagglutination)
2. Diagnostique sérologique d’une infection bactérienne en recherchant des Ac dirigés

contre une bactérie donnée (ex : agglutination de salmonella typhi pour le diagnostic de
la typhoïde)
On fait plusieurs dilutions du sérum d’un patient et on les place en contact d’une quantité
fixe d’une bactérie donnée. Le dernier tube montrant une agglutination visible reflètera
le titre de l’Ac sérique (il est l’inverse de la dilution correspondante). Le diagnostic
d’une infection est donné à partir d’un certain titre.
2) Agglutination indirecte ou passive

L’Ag soluble est fixé sur une particule n’intervenant pas dans la réaction Ag-Ac (hématie de mouton,
billes de latex, cristaux de cholistérol,…..)
Test de Coombs Direct Test de Coombs indirect

On recherche des anticorps présent sur les On recherche des Ac anti-hématie dans le sérum
hématies du malade (auto-immunité, du malade.
immunoallergie médicamenteuse,
incompatibilité rhésus fœto-maternelle….)
Recherche du facteur rhumatoïde (IgM anti-IgG rencontrée chez les patients atteints de certaines
maladies comme la polyarthrite rhumatoïde) par
• Test au latex : les IgG humaines sont fixées sur des particules de latex
• Test de Waaler-Rose les IgG sont fixées sur des globules rouges de mouton.
B-Méthodes utilisant un marqueur

I. Techniques d’immunofluorescence
Les Ac sont marqués par un fluorochrome (fluoresceine, rhodamine,
phycoérythrine….) qui absorbe la lumière d’une certaine longueur
d’onde (excitation) et émet de la lumière d’une autre longueur d’onde
(émission) qui est vue en microscope à fluorescence équipé d’une
source de lumière UV.
La fixation du corps fluorescent sur les Immunoglobulines (Ig)
n’altère pas leurs propriétés immunologiques (Reconnaissance
spécifique de l’antigène).
Ces Ac permettent le marquage des molécules membranaires cellulaires ou des coupes de tissus.
I.1 Réactions d’Immunofluorescence Directe (IFD)

Cette méthode nécessite le marquage de l’antisérum spécifique de chaque antigène.
I.2 Réactions d’Immunofluorescence Indirecte (IFI)

Le marquage d’un seul type d’immun-sérum (anti-IgG, IgM, IgA humaines) permet la détection
de tous les Ac à rechercher. Ainsi, cette méthode n’a, donc, pas les inconvénients de l’IFD.
L’IFI est utilisée pour la recherche des Ac (ou auto-Ac) ➔ Méthode de choix dans le diagnostic
immunologique des Maladies Auto-Immunes (MAI).
II. Techniques immuno-enzymatiques

Ces techniques utilisent des Anticorps marqués par des enzymes
qui catalyser des réactions irréversibles. Le couplage à l’anticorps
ne change pas l’immuno-réactivité de ce dernier.
Le substrat de ces enzymes (chromogène) est soluble et incolore.

L’action de l’enzymatique le transforme en un produit coloré.
Différentes enzymes sont utilisées : la peroxydase, la phosphatase alcaline,
bétagalactosidase……
Ces techniques sont appelées techniques ELISA : Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assays
Différents types des techniques ELISA

ELISA Directe
L’Antigène à doser est Fixé sur un support. La révélation se fait par l’ajout d’un conjugué
« Anticorps spécifique de l’Antigène marqué par une Enzyme ».
ELISA indirecte
L‘Anticorps à doser est pris entre l‘Antigène et un Anticorps anti-Ig marqué « Anticorps anti-
Ig humaine marqué par une enzyme ».
ELISA Sandwich
L‘Antigène doit posséder deux épitopes (déterminants antigéniques) différents === il est pris
en « Sandwich » entre deux Anticorps.
ELISA par compétition

➢ Dosage d’un Ag
Des molécules marquées (Ag*) et non marquées (Ag), d’une même espèce, entrent en
compétition vis-à-vis d’un nombre limité de sites de liaison des Ac spécifiques. Une fois
l’équilibre est atteint, l’intensité de la coloration produite est inversement proportionnelle à la
concentration de la substance qu’on veut doser (Ag).
➢ Dosage d’un Ac
Des Ac* marquées et des Ac non marquées, ayant une même spécificité, entrent en compétition
vis-à-vis d’un nombre limité d’Ag spécifiques. Une fois l’équilibre est atteint, l’intensité de la
coloration produite est inversement proportionnelle à la concentration de l’Ac qu’on veut doser.
III. Techniques radio-immunologiques

Ces techniques utilisent des Anticorps ou des antigènes marqués par des
substances radioactives. Le marquage ne doit pas modifier les propriétés
physico-chimiques et immunologiques l’Anticorps vis-à-vis son Ag.
III.1. Radio-Immuno-Dosage par Compétition
Des molécules marquées (Ag*) et non marquées (Ag), d’une même espèce, entrent en
compétition vis-à-vis d’un nombre limité de sites de liaison des Ac spécifiques. Une fois
l’équilibre est atteint, le pourcentage de forme liées « Ag*- Ac » est inversement proportionnel
à la concentration de la substance que l’on veut doser (Ag).
La réalisation d’un tel dosage nécessite le recours à des solutions étalons de concentration
connue et croissante en Ag marqué : R1, R2, R3, etc.
La détermination de la concentration de la substance à doser, dans un milieu biologique, se fait

graphiquement par extrapolation.
III.2 Radio-Immuno-Dosage Sans Compétition

Capturer les molécules à doser, grâce à des Anticorps fixés sur un support solide puis les révéler
à l’aide d’Anticorps marqués (conjugués) par un isotope radioactif.
Dans ces conditions, plus la concentration de la substance à doser augmente, plus la

radioactivité des complexes « Ac – Ag – Ac* » augmente ➔ Directement Proportionnelle.

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Selon la méthode de révélation de ces complexes on distingue plusieurs techniques :

➢ Méthodes utilisant un marqueur

A-Méthodes n’utilisant pas de marqueurs

I.1 Techniques de précipitation en milieu liquide

2) Néphélométrie / turbidimétrie LASER

La mesure est très sensible, rapide et automatisée, permet un dosage quantitatif.

I.2 Techniques de précipitation en milieu semi-solide

Principales applications en immunochimie

3) Immuno-diffusion radiale de Mancini

Principale application en immuno-chimie

• Dans un 2ème temps : l’ajout de l’anti-IgA et sa diffusion entraîne la précipitation des

II. Techniques d’immuno-agglutination

II.1 Paramètres intervenant dans l’agglutination

II.2 Types d’agglutination immunologique

Cette méthode est largement appliquée pour :

2. Diagnostique sérologique d’une infection bactérienne en recherchant des Ac dirigés

2) Agglutination indirecte ou passive

Test de Coombs Direct Test de Coombs indirect

B-Méthodes utilisant un marqueur

I.1 Réactions d’Immunofluorescence Directe (IFD)

I.2 Réactions d’Immunofluorescence Indirecte (IFI)

II. Techniques immuno-enzymatiques

Le substrat de ces enzymes (chromogène) est soluble et incolore.

Différents types des techniques ELISA

ELISA par compétition

III. Techniques radio-immunologiques

La détermination de la concentration de la substance à doser, dans un milieu biologique, se fait

III.2 Radio-Immuno-Dosage Sans Compétition

Dans ces conditions, plus la concentration de la substance à doser augmente, plus la

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