TD1 Initiation A La Culture Cellulaire

TD 1:
Initiation à la culture
cellulaire
Plan
 Pourquoi une culture cellulaire?
 C’est quoi une culture cellulaire?

 Définition
 Culture primaire
 Culture secondaire
 Culture des lignées cellulaires
 Comment faire une culture cellulaire?

 Les sources
 Les milieux de culture
 Environnement de culture
 Matériel et instruments
 Contaminations et précautions
C’est quoi une culture cellulaire?
 C’est une technique de laboratoire pour faire vivre des

cellules in vitro
 C’est le prélèvement de cellules, d'un animal ou d'une

plante et leur placement ultérieur dans un environnement
artificiel conduisant à leur croissance
 Le but est de multiplier des cellules ou de les maintenir

vivantes pour les utiliser
Culture cellulaire
Fragment d’organe Après quelques jours
ou de tissu
Milieu de culture adapté
Dissociation mécanique et enzymatique
Action mécanique (broyer, émincer)

Action d’enzymes protéolytiques Mise en culture
(trypsine, collagénase)
Suspension cellulaire
Culture cellulaire
Cas de la cellule végétale: Culture d’explant
• Un explant + un milieu de culture stérile+ un environnement

favorable de croissance
Culture cellulaire
Cas de la cellule végétale: Culture d’explant
Pourquoi mettre des cellules en culture?
 Matériel en grande quantité
 Conservation des caractéristiques du tissu initial
 Homogénéité des cellules
 Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués
 Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire
 Pour la production de:

• Vaccins
• Protéines thérapeutiques (anticorps, agents immunologiques,
Hormones)
• Tissus
• Vecteurs viraux
• Cellules souches
Culture cellulaire
 Culture primaire
Culture cellulaire  Culture secondaire
 Culture de lignées cellulaires

Culture primaire
Lorsque les cellules sont prélevées
Culture directement d'un tissu et placées dans un

Primoculture
primaire environnement de culture approprié, elle
se divisent et prolifèrent
Culture primaire
Fragment d’organe Après quelques jours
ou de tissu Culture primaire
Milieu de culture adapté
Dissociation mécanique et enzymatique

Culture primaire
Action mécanique (broyer, émincer)

Action d’enzymes protéolytiques Mise en culture
(trypsine, collagénase)
Suspension cellulaire
Culture primaire
Avantages
 Proche de la "réalité" de la vie d'une cellule
Inconvénients
 Matériel en faible quantité
 Mélange de différents types cellulaires
 Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture que

pendant quelques générations
Culture secondaire
 Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire ont poussé et
couvert tout le substrat de culture disponible (arrivent à confluence),
elles doivent être décollées du support, dispersées et réensemencées à
une densité plus faible dans un nouveau récipient de culture avec du
milieux frais
Cette opération est appelée: repiquage
Culture secondaire
 C’est une culture obtenue par repiquage à partir d’une culture

primaire (ou d’une autre culture secondaire)
Culture secondaire
Repiquage
Culture primaire Culture secondaire

Lignée cellulaire
 Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules,

stables après des mitoses successives, et ayant en théorie une
capacité illimitée de division (entretien in vitro par repiquages
successifs)
 Il s'agit en général de:

• Cellules cancéreuses, cellules prélevées sur une tumeur au départ
• Cellules saines rendues immortelles (transformation =
cancérisation) par traitement mutagène:
 chimique
 physique
 par utilisation de virus oncogènes
Lignée cellulaire
 Une lignée peut être :
• à durée de vie limitée :
on observe une dégénérescence (vieillissement)

des cellules au bout d’un certain nombre de
repiquages
• à durée de vie illimitée:
elle est alors appelée lignée continue

Culture cellulaire
Les sources de cellules
Deux sources de cellules sont possibles :

1- Les cellules circulantes (en suspension )
 Indépendance vis-à-vis de l’ancrage
 Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture
(avec ou sans agitation)
(Exemple: Sang, moelle osseuse, liquides physiologiques)
2- Les cellules adhérentes à partir de tissus ou d'organes

 Dépendance vis-à-vis de l’ancrage
 Nécessité d’être attachées entre elles et ancrées sur un
support pour survivre
Les milieux de culture
 Généralement constitués de:
• Récipients de cultures appropriés (en verre ou en plastique)

• Contenant un milieu qui apporte les nutriments essentiels à la survie et à
la croissance
 Le milieu de culture doit reproduire aussi fidèlement que possible les conditions
de l’environnement que les cellules trouvaient in vivo:
• Apporter des éléments nutritifs

• Contribuer au maintien des conditions physico-chimiques comme le pH
et l’osmolarité
• Permettre la prolifération des cellules (divisions cellulaires)
Milieu de culture minimum
C’est un milieu comportant les éléments chimiques (sous une forme utilisable)
strictement nécessaires à la croissance de la cellule:
 L’eau, indispensable à toute forme de vie (eau distillée stérile)
 Une source de carbone et d'énergie (le glucose)
 Une source d’azote
 Des sels minéraux (K2HPO4 ou KH2PO4 ; MgSO4; MgCl2; CaCl2 …)
 Une source d’oligo-éléments (fer, zinc, manganèse, cuivre, cobalt, molybdène)
 Un pH constant (grâce au système tampon CO2/HCO3)

Milieu de culture empirique
 Il contient des composants indéfinis (des extraits de viande, des extraits de

levures, peptones, des liquides biologiques ...)
 Une composition approximative
 Ce sont des milieux très riches en substances organiques permettant une

croissance aisée de nombreuses cellules
Milieu de culture synthétique ou défini
 Milieu constitué de substances chimiques pures
 La composition qualitative et quantitative est rigoureusement connue.

Quel milieu de culture utiliser?
 Il y a plus de 200 types cellulaires chez les animaux et les végétaux

qui différent selon:
• La localisation anatomique
• L'état de différenciation
 Le choix du milieu de culture se fait en fonction du type cellulaire

ou de l'expérience à réaliser
Boîtes de pétri
Tubes à essai
Flacons de culture
Plaques Multipuits Erlenmeyer

Environnement de culture
Les paramètres à respecter:
 Température T= 37°
 Hygrométrie de 84 à 85 % d’humidité
 pH à 7.4 maintenu avec:

• les tampons du milieu
• l’atmosphère à 5% de CO2 dans l’étuve
d’incubation
Matériel et instruments
La stérilisation
Autoclaves
Chaleur + Pression
PSM: Poste de Sécurité Microbiologique
Hotte à flux laminaire
Hotte à flux laminaire : Manipulation du matériel animal
ou végétal sous conditions stériles
Hotte à flux laminaire : Manipulation du matériel animal
ou végétal sous conditions stériles
 Ne pas introduire trop d'objets (perturbe le flux et la sécurité)
 Ne pas introduire d'objet poussiéreux (colmate les filtres)
 Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile
 Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile
 Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche
 L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite
 Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile

Micropipette Eppendorf Boîtes de pétri + Flacons de culture
Micropipette Eppendorf Plaques Multipuits

Chambre de culture: Matériel végétal Incubateur: Matériel animal

Observation par microscope photonique (optique)
Contaminations
Contaminants biologiques
 Bactéries
 Levures/moisissures
 Virus
 Mycoplasmes
Contaminants chimiques
 Endotoxines
 Qualité du plastique
 Reste de détergent
 Trace d’aluminium
 Résidus désinfectants
Contamination croisée
 Autres cellules
Techniques Aseptiques pour la culture cellulaire
 Se laver les mains avant après.

 Port de gants et blouse
 Cheveux attachés
 Nettoyage du plan de travail (Ethanol 70%,
détergent désinfectant )
 Tout ce qui est en contact avec la culture doit être
stérile (flasques, pipettes, tubes…)
 Nettoyer le matériel (mettre sous la hotte)
Merci de votre attention

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 C’est quoi une culture cellulaire?

 Comment faire une culture cellulaire?

 C’est une technique de laboratoire pour faire vivre des

 C’est le prélèvement de cellules, d'un animal ou d'une

 Le but est de multiplier des cellules ou de les maintenir

Milieu de culture adapté

Dissociation mécanique et enzymatique

Action mécanique (broyer, émincer)

• Un explant + un milieu de culture stérile+ un environnement

 Conservation des caractéristiques du tissu initial

 Homogénéité des cellules

 Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués

 Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire

 Pour la production de:

Culture cellulaire  Culture secondaire

 Culture de lignées cellulaires

Lorsque les cellules sont prélevées

Culture directement d'un tissu et placées dans un

Milieu de culture adapté

Dissociation mécanique et enzymatique

Action mécanique (broyer, émincer)

 Proche de la "réalité" de la vie d'une cellule

 Matériel en faible quantité

 Mélange de différents types cellulaires

 Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture que

 C’est une culture obtenue par repiquage à partir d’une culture

Culture primaire Culture secondaire

 Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules,

 Il s'agit en général de:

 Une lignée peut être :

• à durée de vie limitée :

on observe une dégénérescence (vieillissement)

• à durée de vie illimitée:

elle est alors appelée lignée continue

Deux sources de cellules sont possibles :

2- Les cellules adhérentes à partir de tissus ou d'organes

 Généralement constitués de:

• Récipients de cultures appropriés (en verre ou en plastique)

• Apporter des éléments nutritifs

 L’eau, indispensable à toute forme de vie (eau distillée stérile)

 Une source de carbone et d'énergie (le glucose)

 Une source d’azote

 Des sels minéraux (K2HPO4 ou KH2PO4 ; MgSO4; MgCl2; CaCl2 …)

 Une source d’oligo-éléments (fer, zinc, manganèse, cuivre, cobalt, molybdène)

 Un pH constant (grâce au système tampon CO2/HCO3)

 Il contient des composants indéfinis (des extraits de viande, des extraits de

 Une composition approximative

 Ce sont des milieux très riches en substances organiques permettant une

Milieu de culture synthétique ou défini

 Milieu constitué de substances chimiques pures

 La composition qualitative et quantitative est rigoureusement connue.

Quel milieu de culture utiliser?

 Il y a plus de 200 types cellulaires chez les animaux et les végétaux

 Le choix du milieu de culture se fait en fonction du type cellulaire

Plaques Multipuits Erlenmeyer

Les paramètres à respecter:

 pH à 7.4 maintenu avec:

 Ne pas introduire trop d'objets (perturbe le flux et la sécurité)

 Ne pas introduire d'objet poussiéreux (colmate les filtres)

 Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile

 Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile

 Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche