IMMUNOFLUORESCENCE

PLAN

I° DEFINITION

II°PRINCIPES DE l’IMMUNOFLUORESCENCE
1.IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE
2. IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

III° AVANTAGES ET INCONVENIANTS

IV° DOMAINES D’UTILISATION

1.DIAGNOSTIC
2. RECHERCHE FONDAMENTAL
 I° DEFINITION

 L'immunofluorescence est une technique de laboratoire employée pour déterminer la présence et la

localisation d’un antigène dans une préparation microscopique (coupe de tissu, frottis cellulaire,
étalement microbien), ou d’un anticorps dans un sérum pathologique.

II°PRINCIPES DE l’IMMUNOFLUORESCENCE

 Il existe deux types de fluorescence:

 La fluorescence dite « naturelle », ou auto-fluorescence, émise spontanément par la cellule. On peut citer par
exemple la chlorophylle des cellules végétales.

 La fluorescence conférée par un fluorochrome, substance chimique qui émet de la lumière si elle est excitée à
une certaine longueur d’onde.
 Technique : immunofluorescence

Exemple : anticorps marqué à la fluorescéine

Les colorants fluorescents en vert les plus connus sont des dérivés de la fluorescéine
comme le FITC (Fluoresceine Iso Thio Cyanate).

 Principe général de l'immunofluorescence

 Si l'on veut détecter une substance X non soluble (donc fixée) dans la cellule, on l'utilise comme un antigène en
l'injectant à un lapin. Celui réagit en fabriquant des anticorps (immunoglobulines) anti-X.

 Sur la préparation cellulaire, les anticorps anti-X se fixent spécifiquement sur X.

 On pourrait fixer une molécule de fluorescéine directement sur ces anticorps mais il est plus aisé d'utiliser des anticorps
de chèvre anti-immunoglobulines de lapin soudés à une molécule de fluorescéine.
 1.IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE

 Lors de ce marquage, on utilise un anticorps dirigé contre la molécule recherchée, appelée antigène.
Cet anticorps est couplé à un fluorochrome. Ensuite pour révéler la préparation, on peut utiliser un
microscope à épifluorescence ou un microscope confocal. Cette technique reste une des plus utilisées
dans la recherche scientifique.

2. IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

L'immunofluorescence indirecte est basée sur l'utilisation successive de 2 anticorps :

 le premier anticorps de type monoclonal reconnait spécifiquement la protéine d’intérêt.

 Le second anticorps de type polyclonal est dirigé contre l'anticorps primaire (le premier).

 C'est le second marquage. Dans ce cas, on a deux anticorps. L’anticorps primaire est dirigé contre
l’antigène recherché.

 Ensuite on utilise un deuxième anticorps, marqué par un fluorochrome, et possédant une haute affinité
pour l’anticorps primaire (dirigé contre l’isotype de l’anticorps primaire, il s'agit alors d'une antiglobuline
.).
III° AVANTAGES ET INCONVENIENTS

 Comme avantages, il y a la possibilité de réaliser des marquages multiples sur un même échantillon de
cellules, la rapidité et la facilité d'utilisation de cette méthode et aussi une bonne fiabilité de celle-ci.

 De plus en immunofluorescence indirecte, on a une augmentation de l’intensité lumineuse, car il y a

plusieurs sites de fixation sur les anticorps primaires, ce qui permet d’avoir plusieurs anticorps
secondaires fixés dessus.

 Mais il y a quelques inconvénients. Par exemple, la possibilité de réactions faussement positives ou

faussement négatives, l'appréciation subjective du degré de fluorescence et le phénomène de photo-
blanchiment.

 Pour pallier ces inconvénients, il existe plusieurs techniques. Tout d’abord, réaliser un témoin négatif
pour l’immunofluorescence indirecte, c'est-à-dire ne mettre que les anticorps secondaires (marqués)
en contact avec l’échantillon à analyser.

 Après une étape de lavage, si le témoin négatif est bon, il ne doit pas avoir de fluorescence émise, car
les anticorps secondaires n’ont pas pu se fixer, et ils sont donc partis après l’étape de lavage.

 Ensuite, l’utilisation de caméra haute résolution et haute sensibilité atténue le photoblanchiment et

permet une étude quantitative de l'acquisition.
IV° DOMAINES D’UTILISATION
1. DIAGNOSTIC

 En bactériologie, on utilise l’immunofluorescence pour une détection directe de bactéries dans les
liquides biologiques. Mais aussi pour la recherche d’anticorps anti-microorganisme, par
immunofluorescence indirecte.

 En virologie, l’immunofluorescence directe est utilisée pour réaliser des cinétiques d’apparition
d’antigène cellulaire ou viral. Et l’immunofluorescence indirecte est employée pour une recherche
d’un virus d’infection.

 En anatomie pathologique (réalisation d’une biopsie), l’immunofluorescence directe sert à déceler les
dépôts d’immunoglobulines ou des protéines du complément dans les tissus.

 Ensuite en cancérologie, on peut quantifier l’expression d’oncogènes par cytofluorimétrie

 . Enfin, l’immunofluorescence peut servir à déterminer la qualité du sperme, afin de diagnostiquer une
stérilité.
.
2.La recherche fondamentale

 Observation de la division cellulaire

 Analyse du cycle cellulaire, dont l'apoptose

 Activation cellulaire

 Hybridation moléculaire

 Localisation intracellulaire, on peut utiliser la vidéomicroscopie, mais aussi les protéines recombinantes
QUESTIONS?