Ecolé Supérieure des Sciences et Techniques de la Santé de Monastir

(ESSTSM)

Chapitre N°1: Les anticorps

monoclonaux et recombinants

Immunotechnologie et Vaccinologie
2ème année Biologie médicale
Année universitaire 2022/2023

1
 Rappel de la structure d’une Ig

4 chaînes polypeptidiques identiques NH2

2 à 2 et assemblées en Y:
-2 chaînes lourdes H (Heavy)
-2 chaînes légères L (Light) COOH

2
 Notion de domaine des Igs

Ø Chaine H composée de 460 AA

comprend 2 extrémités :

•  N terminale (partie variable de

la chaine H « VH »)
•  C terminale (partie constante
de la chaine H « CH »)

Ø Chaine L composée de 213-218

AA, comprend 2 extrémités :

§ N terminale (partie variable de la

ch L « VL »)
§ C terminale (partie constante
de la ch L « CL »)
3
 Paratope et régions variables
La Région variable d’un AC subdivisée en :
§  Régions hypervariables: (CDR= Complemontarity Determining
Région)
§  régions variables : régions charpentes (FR= framework region)

6 zones hypervariables

6 zones
hypervariables

4
Les 6 CDR (3+3) constituent le paratope
Intérêts respectifs des anticorps polyclonaux et
monoclonaux
Schéma récapitulatif de la production des anticorps
monoclonaux
 Antisérum:
Ø Extrait du sang d'un animal ou d'un homme contenant des
anticorps différents (environ une dizaine de clonotypes) dirigés
contre plusieurs épitopes du même Ag.

Ø  Cette préparation est dite polyclonale.

7
 Préparation de l'antisérum

Immunogène
Antigène - carrier
Adjuvant de Freund

IMMUNISER SAIGNER

Sérum

Caillot

PRELEVER Rajouter 50% de glycérol

CENTRIFUGER
le surnageant et stocker à -20°C14
Immunisation de Ablation de la rate et
la souris extraction des LB

Cellules de
myélome
immortelles.

9
10
 Immunisatio Ablation de la rate
n de la et extraction des
souris LB

Cellules de
myélome
(division
cellulaire rapide et
immortelles)

lors de la fusion entre LB et + PEG

Fusion
myélomes, on peut obtenir (polyéthylène cellulaire
des fusions non souhaitées glycérol)
type : LB/LB
Myélome/myélome
voire pas de fusion du tout. Hybridome

C'est pourquoi il existe des Culture sur milieu de

moyens de sélection de nos sélection
hybridomes HAT
hypoxanthine-aminoptérine-thymidine

11
 OBTENTION DE PARTENAIRES DE FUSIONS
MUTANTS
TK:thymidine kinase,
HGPRT:hypoxanthine-guanine
phosphoribosyl-transférase :
§ Dans une cellule normale, la
synthèse d'ADN se fait /
-par la voie exogène à partir
de l'hypoxanthine et de la
thymidine,
-par la voie endogène de sauvegarde
qui fait appel aux AA et aux sucres .
Les myélomes fusionneurs
déficitaires en TK ou HGPRT sont des
mutants sélectionnés par culture dans
des milieux contenant des analogues
soit de l'hypoxanthine (8- azaguanine)
soit de la thymidine (bromo-déoxy-
uridine).
De l'ADN anormal est synthétisé si les
cellules sont respectivement HGPRT+
ou TK+ . Ces cellules ne sont pas
viables et ne survivent que les mutants
29
TK- ou HGPRT-.
SELECTION DES HYBRIDOMES
• Pour séparer les hybrides des cellules du
myélome, on choisit comme lignée
myélomateuse servant à l'hybridation, des
cellules déficitaires en enzyme
hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-
transférase (HGPRT)
• Si l'on bloque la voie de sauvetage en
introduisant de l'aminoptérine dans le
milieu, les cellules myélomateuses ainsi
que des lymphocytes B nornaux qui ont
une courte vie mourront.

Donc après la fusion, les cellules

sont cultivées dans le milieu HAT
(hypoxanthine, aminoptérine, thymidine) de
Littlefield qui ne permet la survie que des
hybridomes qui ont reçu HGPRT + des
lymphocytes B

30
 Culture sur milieu HAT
+ Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine

Cellule myélomateuse HGPRT-

Cellule myélomateuse Fusionnées avec des LB Lymphocyte B

MORT CELLULAIRE HYBRIDOME MORT CELLULAIRE

Impossibilité de se SELECTIONNE disparition aprés
diviser quelques
divisions
Ces myélomes Ces hybridomes
mutants meurent dans sont capables Les LB non fusionnées
un milieu contenant de proliférer dans ce produisant des Ac sont
l’aminoptérine parce milieu et de incapable de croitre in
qu’ils sont incapable produire des Ac. vitro 31
de biosynthétiser des
nucléotides
Pour isoler des clones ne produisant qu'une seule espèce d'Ac,
on a
recourt à :

La technique des la cytométrie de

dilutions limites flux

15
 On dilue les hybridomes à une concentration très faible.
On prépare des cultures avec de très petits volumes.

PRODUCTION

Screening des microcultures primaires pour leur

croissance:
TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUITS

-Tester la présence d’AcM dans le surnagent des cultures cellulaire par 35la
technique ELISA.
P
+
R
O
D
U
C Production par
T Amplification des cultures
I hybridomes cellulaires
O
N

OBTENTION DES
D ANTICORPS
E MONOCLONAUX
S
Production dans
A les liquides
C d'ascites
M CONSERVATION
DES
HYBRIDOMES

17
PRODUCTION
D’ANTICORPS
MONOCLONAUX

18
 Production par culture cellulaire

•  Ces clones doivent être alors l'objet de cultures massives pour

produire des quantités importantes d'AcM (faites in vivo).
•  Transférer les cultures sécrétant les Ac dans des puits de plus en
plus grands, pour les amplifier

19
 2. Chromatographie d'affinité :

Ø avec la protéine A ou la protéine G comme ligand (protéines de

source bactérienne ayant la capacité de se fixer sur la région Fc des
Ac)……
Ø  avec l'antigène comme ligand (Fab) pour purifier l'Ac spécifique
Chromatographie Chromatographie
d'affinité avec l’Ag d'affinité avec la
comme ligand protéine G ou A

Antigène spécifique du ligand Fab de l’Ac Proteine G ou A ayant la capacité de se4f3ixer

sur la région Fc des Ac
 Les colonnes de chromatographie classiques sont
remplacées par des billes magnétisées de résine sur lesquelles
est lié le ligand choisi. +++

21
 Ag Ag

VH
VL CH1
CL

CH2

Muromonab rituximab CH3 Trastuzumab Adalimumab

Anti-CD3 Régions variables Anti- HER2/neu anti-TNF alpha
murines couplées à
des parties constantes ne contenant
humaines que les régions
hypervariables
(CDR) murines
22
 ANTICORPS CHIMERIQUE OU HUMANISE

Réponse
% 100 40% 7% 0% HAMA
protéines %
murines
23
 La méthode Phage-Display
1.  Extraction de l’ARNm d’un
plasmocyte ou d’une cellule
B (Hybridomes ,
splénocytes ou cellules du
sang)
2.  Obtention du cDNA par
action de la transcriptase
reverse
3. Amplification du cDNA par
(PCR)
4. Sélection des gènes codant
pour les chaines lourdes et
légères
5. Construction d’un plasmide
avec les deux gènes
6. Intégration dans un phage
pour expression
7. Sélection et mise en culture
du bactériophage pour
introduction dans le système Un bactériophage (ou phage) est un virus n'infectant
d’expression que des bactéries. Ce sont de vecteurs de clonage
de gènes.
8. Extraction des
51
anticorps
sécrétés
Grace à la PCR, il est possible de produire des anticorps humains par
des banques combinatoires d’ADNc codant les fragments variables
d’anticorps et isolés à partir d’ARN totaux de LB humains.

• Cette technique du phage-display donne des anticorps d’affinité

variabl5e2.
53
2- Production d’anticorps entièrement humains par des
lignées de souris transgéniques

Les souris transgéniques sont les souris contenant une partie des
gènes humains: les gènes codant pour les immunoglobulines G 54
murines
28
3- Production d’anticorps humains par un système
complètement humain par culture

LB ont pu être immortalisés

par le virus d’Epstein-Barr
ou fusionnés avec des
cellules de myélomes
humains (non sécréteurs)

la difficulté d’obtenir
des LB humains de
rate rend difficile cette
application

29