CULTURES CELLULAIRES Master 2: biochimie appliquée Dr

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A
Techniques de cultures cellulaires

1. définition

En biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble de techniques

utilisées pour faire croitre des cellules hors de leur organisme (ex-vivo)
ou de leur milieu d'origine dans un but d'expérimentation scientifique ou
de fécondation in vitro.
2. Types de cellules
Les cellules cultivées sont généralement décrites d'après leur
morphologie (forme et apparence) ou leurs caractéristiques
fonctionnelles.
il existe trois types de morphologies de base:
 Type épithélial:
ces cellules sont attachées à un substrat et apparaissent plates et de
forme polygonale
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 Type lymphoblaste:
ces cellules ne se fixent pas normalement à un substrat mais restent
en suspension avec une forme sphérique .

 Type fibroblaste:
ces cellules sont attachées à un substrat et apparaissent allongées et
bipolaires

3. Les types de culture cellulaire

 La culture primaire

Les cellules des tissus sont dispersées par hydrolyse enzymatique des
protéines constituant la matrice extracellulaire. la multiplication des
cellules s'arrête quand un élément du milieu nutritif est épuisé.
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quand elles sont cultivées sur support, leur croissance s'arrête pat
inhibition de contact c'est à dire quand elle forment un tapis confluent de
monocouche cellulaire.
 La culture secondaire
Ce sont des cellules de culture primaire qui sont utilisées pour
ensemencer d'autres cultures ainsi de suite : ce sont donc des cultures
secondaires. ces cellules ainsi obtenues conservent les caractéristiques du
tissu d'origine mais leur nombre de division est limité comme dans
l'organisme

 Les lignées cellulaires

Les cellules qui ont subi des modifications génétiques leur permettant
une croissance indéfinie proviennent de tumeurs spontanées ou de
cellules transformées par immortalisation (durée de vie indéfinie).
4. Les conditions de culture
-Oxygène : Les cellules animales sont aérobies strict, l'apport d'oxygène
est donc indispensable.
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-Température : les cellules doivent être placées a la température qui
correspond a celle de l'organisme (généralement à 37°c ).
-PH: les cellules doivent être placées au PH de l'organisme dont elles
sont issues .
-Osmolarité: A fin de prévenir l'augmentation de l'osmolarité du milieu
due à l'évaporation, l'atmosphère de l'incubateur est doit être saturée en
vapeur d'eau ( 84-85%).
5. Origine et obtention des cellules
On distingue deux types de cellules dans l'organisme:
Les cellules circulantes ou libres telles que les cellules sanguines et les
cellules des tissues solides.
Les premières sont récupérées facilement par centrifugation différentielle,
alors que les secondes peuvent être récupérées selon deux procédés:
-Migration cellulaire à a partir d'explant
-Dissociation du tissu avec libération des cellules.
6. La culture des cellules
Il existe deux types de cultures des cellules :
La culture en suspension : tels que les lymphocytes, la moelle osseuse,
certains types de tumeurs comme les tumeurs à petites cellules
rondes....etc.
les cellules flottent dans le milieu et prolifèrent en suspension
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La culture de cellules adhérentes:
culture en support :
Adhésion des cellules sur la paroi au fond du flacon ou de la boite de
culture

A. Milieux de culture
Exigences cellulaires minimales
Eau, ions minéraux (osmolarité), source de carbone et d'énergie
(glucose), source d'acide gras, PH constant 7.4, solution tampon
Complément variable selon les milieux
Acides aminés, vitamines et cofacteurs, bases azotées ribose et
désoxyribose.
Mélange d'antibiotiques a 1%
Pénicilline G, Streptomycine, et antifongique.
Glutamine à 1%
Sérum de veau fœtal
B. Matériel
la culture cellulaire nécessite des conditions de stérilité absolues, toute
contamination microbienne entraine la lyse des cellules, De plus lorsque
l'on fait de la production, le produit obtenu doit être stérile. C'est
pourquoi on manipule dans des sales réservées à cet effet on utilise des
hottes à flux luminaires équipées de système de filtration d'air (PSM) et
permet d'obtenir une zone de manipulation stérile
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PSM

C. Le support
On utilise des supports pour les cellules adhérentes:
-Boites stériles en polystyrène: elles ne présentent pas de toxicité pour les
cellules et permettent d'observer parfaitement les cellules en microscopie
optique.
-Des lames de verre ou des microplaques

Les cellules non adhérentes sont cultivées dans les mêmes conditions
mais se développent en suspension
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D. Les étuves d'incubation

Les cellules sont cultivées dans des étuves thermostatées (37°C pour les
cellules des mammifères) avec 5% de co2 sous forme gazeuse.ces étuves
doivent être décontaminées régulièrement .
E. Les contaminants
Contaminant biologique: Bactéries, levures, virus mycoplasmes
Contaminant chimique: qualité de plastique
Contaminant croisé : Autres cellules.
7. La conservation des cellules
La congélation : en présence
d'agents cryo-protcteurs:DMSO(diméthylsulfoxyde): protége les
membranes lysosomilaes et empéche le relarguage des préteiines
Glycérol
La décongélation :
elle est rapide à 37°C et suivie d'un lavage et d'un controle de viabilité
Controle de viabilité
Dénombremment en présence d'un colorant pour éstmitation de viablité
céllulaire
Bleu de funk ou trypan exclu dans des céllules vivantes et pénétrant dans
des cellules mortes sous le microscope inversé .