Université des Frères MENTOURI Constantine - 1

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie et Ecologie Végétale

Licence en : Biologie et Génomique Végétales

Cours de : Biotechnologie végétale

Titre :
Bases Biologiques des cultures in
vitro

Présenté par : KELLOU K

 La culture in vitro
A. Historique

Premiers travaux dus à Darwin (1880) : observation des réactions

phototropiques de coléoptile de blé.

Phototropisme : réponse de croissance à une distribution dissymétrique de

la lumière. Est
Est--ce la base qui capte le signal ou une autre zone du
coléoptile?
Compléments de Boysen-Jensen (1910) La dissymétrie de la lumière
constitue un stimulus, capté par l’apex et transmis au reste du coléoptile
par l’intermédiaire d’une substance chimique mobile et soluble.

Compléments de Went (1928) La substance provoque l’allongement du

coléoptile seulement du côté où elle est appliquée.

Cette molécule a été identifiée et décrite par Kogl et Haagen-

Haagen-Smith (1931)
Elle fut nommée AUXINE en raison de l’auxèse qu’elle provoque.
La synthèse se fait très majoritairement en haut de la plante.
 La culture in vitro
A. Historique
1935, Gautheret (botaniste) savait que les cellules méristèmatiques étaient
indifférenciées.

Il a voulu savoir si on pouvait rendre n’importe quelle cellule totipotente

totipotente.

Essais avec parenchyme de carotte, but : le maintenir en vie.

Les éléments essentiels du milieu de culture :

-Eau

-Co-facteurs d’activité enzymatique

-sucres

Avec ce milieu, l’explant survie mais se nécrose au bout de 72-96h si on ne

renouvelle pas les ressources.

Il existe des explants de carotte qui survivent ainsi depuis plus de 60 ans!!
 A. Historique

Ensuite, il a ajouté différentes substances dont l’auxine au milieu et il a eu

une prolifération cellulaire = cal (amas de cellules indifférenciées)
Il invente alors le terme de callogénèse
callogénèse.

Les cellules ont toutes les caractéristiques des cellules indifférenciées :

Gros noyau, bcp de mitochondries et de RE, petite vacuole fragmentée…

 A. Historique

Ensuite, Skoog a fait des essais avec du tabac et a progressé sur les RC.

• Skoog (1950) : applique de l’auxine sur cellules de moelle :

grandissement. applique un mélange complexe (lait de coco) :
multiplication.

Toutes les molécules ayant les mêmes propriétés ont été nommées
« cytokinines »
Car elles provoquent la cytocinèse = séparation du cytoplasme d’une cellule
en 2 = base de la division cellulaire.

synergie
Effet de dilution

auxine
cytokinines
 A. Historique

Il a découvert que c’était le rapport des concentrations entre auxine et

cytokinines qui gouvernait la différenciation des cals.

Auxine seule survie

Auxine majoritaire rhizogénèse

Cytokinines majoritaires caulogénèse

Équilibre entre les deux callogénèse

[ AIA]
=1 Multiplication cellulaire mais pas de différenciation
[ CYT]
[ AIA]
<1 Formation de pousses à partir d’une masse de cellules
[ CYT] indifférenciées = caulogénèse
Cytokinines majoritaires

[ AIA]
[ CYT]
>1 Formation de racines = rhizogénèse
Auxines majoritaires Attention : la valeur optimale du rapport dépend de l’espèce
A. Historique
Il est donc possible de piloter la morphogénèse.

Types d’organogenèse contrôlée par des concentrations relatives

d’auxine(s) et de cytokinine(s)
 A. Historique

Puis Murashig a mis au point une technique de mesure des cytokinines

endogènes.

On peut alors adapter précisément le taux de régulateurs à fournir.

Le problème est que le transport cellulaire n’est pas pris en compte.

On prend donc la parti, ensuite, de limiter au maximum les régulateurs

endogènes

donc on réduit la taille de l’explant au maximum jusqu’à des cellules

isolées

Actuellement, on utilise deux grands types de milieux:

-Liquides pour la culture des cellules

-Solides pour la culture des tissus, bourgeons, cals….

A. Historique
Le milieu le plus couramment utilisé est maintenant celui dit
de Murashig et Skoog.
Skoog
A. Historique
 A. Historique
D’autres avancées ont eu lieu plus tard : on a vu qu’on pouvait orienter
différemment la différenciation des cals de plantes vasculaires, à taux
d’auxine constant:

-Faible taux de sucres xylème

-Fort taux de sucres phloème

Logique car le phloème sert à transporter la sève élaborée donc chargée en

sucres.

Quand il y a beaucoup de sucres, il faut les transporter donc il faut du

phloème.
Un taux équilibré en sucres donne les deux types de tissus.
 B. Procédures et techniques

La culture in vitro se décompose en trois phases essentielles et souvent

critiques :

- l’installation
installation = prélèvement du tissu ou des cellules à cultiver. Il faut
désinfecter (alcool+Javel, nécrose, découpage) puis mettre en présence du
milieu de culture.

- la multiplication des individus = se fait en laboratoire, les cals se

développent, il y a alors enracinement et développement de la partie
aérienne.

- l’acclimatation
acclimatation / sevrage = phase la plus critique. Les plants sont
transférés dans de la tourbe. Ils forment de nouvelles racines mieux
adaptées. Ils mettent en place des feuilles nouvelles avec des stomates
fonctionnels.
B. Procédures et techniques

In vitro, les stomates sont ouverts en permanence et non adaptés à

l’atmosphère naturelle.

Cette période de transfert commence par une phase où les végétaux sont
sous une atmosphère saturée en eau :

-Pour assainir le milieu

-Pour que la transition soit moins brutale entre laboratoire et conditions

naturelles.

Les progrès sont permanents dans le domaine de la culture in vitro,

aujourd’hui on arrive à pratiquer l’embryogenèse somatique. Il s’agit de la
production d’un individu à partir d’une cellule non sexuelle.
 B. Procédures et techniques

Il existe même des capsules artificielles

mimant la graine et contenant le milieu de
culture. Les plants germent tous en même
temps mais leur prix est très élevé.
 C. Les applications

Certaines applications ont des buts agronomiques, d’autres scientifiques

par production d’organismes génétiquement originaux.
 1. Multiplication conforme
Micro propagation ou (le clonage végétal)

À partir des années 60-70, le potentiel de multiplication exponentielle de la

culture in vitro est exploité.

La micro propagation in vitro dérive de la multiplication conforme ou le

clonage végétal. On cultive des explants végétaux stérilement, sur un milieu
artificiel et dans un environnement contrôlé.

On sépare les bourgeons les uns des autres et on les repique sur milieu de
culture. Cette opération est répétable toutes les 3-4 semaines.

Suite aux subcultures successives on obtient alors des plantes identiques à la

plante de départ et que l'on peut multiplier à l'infini.
Il est donc possible de produire plusieurs millions d’individus par an.

Par exemple, on peut produire 1.106 fraisiers en un an contre 6 par

multiplication naturelle.
1. Multiplication conforme
Cette technique est maintenant utilisée au stade industriel.

Elle est notamment utilisée pour produire des plantes dont le bouturage est
délicat voire impossible (orchidées….).
Il est toutefois nécessaire, pour chaque espèce, d’adapter le milieu de
culture.
Il existe encore des espèces dont la culture in vitro reste périlleuse
voire impossible.
Bien que cette technique soit sensée fournir des clones, les divisions se
font tellement vite dans les cals, que de nombreuses mutations
apparaissent.
apparaissent

On utilise également cette méthode pour « rajeunir » les végétaux

végétaux.
Certains perdent leur aptitude à former des organes adventifs. On les
multiplie en récupérant leurs méristèmes jusqu’à ce que des feuilles
juvéniles différentes apparaissent.
 2. Guérison des plantes par culture de méristèmes.

En 1950, les travaux de Limasset et Cornuet ont montré que les

méristèmes étaient indemnes de virus.
virus

Même quand une plante est totalement infectée, les méristèmes restent
des zones protégées des virus.

La culture de méristème est une culture aseptique du dôme apical sans

ébauche foliaire sur milieu artificiel.

C'est la seule façon d'obtenir des plantes saines indemnes de virus.

Elle a permis de sauver de nombreuses variétés et espèces de la

disparition suite à une infection.

LES PLANTES OBTENUES SONT INDEMNES DE VIRUS MAIS NE

SONT PAS DEVENUES RESISTANTES AUX VIRUS;
Elles peuvent être recontaminées via des insectes si des mesures de
prophylaxie ne sont pas prises
 3. Culture d’embryons

Cette technique consiste à récupérer des embryons produits au champ ou

in vitro et à les cultiver in vitro.

On peut ainsi régénérer des plantes à partir d’embryons interspécifiques

ou somatiques qui ne sont pas forcément viables en conditions naturelles.

On peut aussi diminuer voire court-circuiter la dormance.

dormance

Cette technique permet donc d’accélérer le cycle végétatif (obtention

plus rapide des générations suivantes).
 4. L'embryogenèse somatique

L'embryogenèse somatique est une forme de multiplication végétative qui

permet d'obtenir une multitude de plantules identiques génétiquement
à la plante donneuse d'explants
d'explants..

C'est l'obtention d'embryons

d'embryons à partir de cellules somatiques,
somatiques, c'est à dire
non sexuelles.

De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoquées à partir

des tissus cultivés grâce à l'apport d'une forte dose d'auxine
d'auxine..

Un cal est alors obtenu, c'est à dire un amas de cellules indifférenciées et

qui pourront donner naissance à des embryons bipolaires qui vont se
comporter comme des embryons zygotiques.
zygotiques.
 5. Culture d’haploïdes et production de lignées pures

En condition naturelle, il existe des homozygotes purs, produits par

parthénocarpie à partir d’un seul gamète.

Il existe aussi des hybridations interspécifiques naturelles.

Mais le développement des individus issus de ces hybridations est rare.

La culture in vitro permet le développement de ces individus et donc

l’obtention de lignées pures.
pures

(les chromosomes sont doublés par la colchicine)

On peut ainsi étudier l’expression de certains allèles récessifs

 6. Culture après fusion de protoplastes

Cette technique permet la création d’hybrides.

d’hybrides

On force des protoplastes (cellules débarrassées de leur paroi) à fusionner

en fragilisant leurs membranes.

En générale, on prend les cellules de limbe de jeunes feuilles.

Cette technique permet aussi de conserver des caractères à hérédité

cytoplasmique puisque les cytoplasmes des deux cellules sont conservés.

Remarque : l’extraction de protoplastes permet aussi la transformation par

électroporation, puis les cellules obtenues sont cultivées in vitro.
électroporation
 7. Culture d’organismes génétiquement modifiés

Les manipulations se font en générale sur des cellules isolées.

isolées

Par culture in vitro, on reconstitue ensuite les individus.

Les modifications génétiques ont pour but :

-De rendre les végétaux résistants aux virus, aux insectes, aux herbicides

-De modifier la qualité de la production

-De faire produire aux végétaux des molécules d’intérêt pharmaceutique

 D. Précautions de culture

DES PRECAUTIONS DE BASES SONT REQUISES POUR REPIQUER

ET CONSERVER LES CULTURES.

LE MOINDRE MICROBE PEUT CONTAMINER LES CULTURES LORS

DE L'INSTALLATION DES BOUTURES OU DES GRAINES.

On peut obtenir des plantes malformées si on ne suit pas rigoureusement la

technique (milieux de culture, équilibre hormonal, cycle de repiquage,
conditions de lumière, de température...).
Dans le cas où tous les individus d'une espèce végétale seraient issus d'un
méristème unique, une maladie nouvelle pourrait avoir des conséquences
catastrophiques, puisque ces individus, génétiquement identiques ou très
voisins, seraient tous également vulnérables à l'agent pathogène ou au
parasite.

La culture in vitro entraîne un risque d'appauvrissement du nombre

d'espèces cultivées puisque cette technique consiste à reproduire des
plantes à l’identique.

micro-propagation in vitro, le coût du plant in vitro est

Dans le cas de la micro-
plus élevé que celui d’une bouture obtenue classiquement.