Cours de Culture in-vitro [4éme Année Phytopathplogie]

I-Méthodologie générale :

1.1 Le labo de CIV : une organisation rationnelle des locaux sont une des
conditions de la rentabilité d’un labo.

Pièce 1 : salle principale réservée à la préparation des milieux de cultures

avec des paillasses équipée de robinets à gaze, à eau, de prises de courant, et un
ou plusieurs éviers avec si possible des étagères.

Pièce 2 : où sont installé un autoclave et un évier pour la vaisselle et le

produit de vaisselles.

Pièce 3 : Contient les produits chimiques

Pièce 4 : Celle des cultures, longue sans fenêtres.

Pièce 5 : la plus propre et la plus calme avec une hotte à flux laminaire pour
un travail en conditions stérile.

Pièce 6 : pour des études de cytologie, histologie…etc.

1.2 Récipients & instruments :

Erlenmeyer, bécher, éprouvette – Pinces, scalpels, ciseaux.

1.3 Conditions d’asepsie :

Les milieux de culture sont très favorables au développement des bactéries et des
champignons dont la Croissance est plus rapide que celle du tissu végétal qui
envahissent la culture.

Les causes de l’infection peuvent être :

* L’aire contient une grande quantité de µorg.

* Les tissus végétales sont recouvert en surface par des champignons et / ou

bactéries.

* Le corps humain qui transporte de multiples µorg.

DeGAÏCHIA Houssem Page 1

Les méthodes d’asepsie :

-Produits chimique : hypochlorite de sodium ou de calcium – éthanol à 70-80% -

divers produits bactéricide ou fongicide

-La verrerie est stérilisée à l’autoclave à 120°C durant 45min

-Les milieux de culture à 110°C durant 25min

II- Milieux de culture :

1-Supports

a) La Gélose :

Le succès et le développement des CIV ont été liés à l’utilisation de la gélose

(agar) qui permet de solidifier le milieu et réaliser un complexe colloïde ayant un
assez faible pouvoir de rétention vis-à-vis des ions. Les concentrations utiliser varie
entre 6-10g/l

b) Bio-gels :

Parfois utiliser dans les gels de polyacrylamides.

c) Les milieux liquides :

Le problème majeur de la CIV sur milieux liquides est l’aération du milieu ; celle-ci
réaliser par agitation vigoureuse.

2-Milieu minéral :

Les macros et les microéléments.

La nutrition en CIV pose des problèmes particuliers. La faible assimilation

chlorophyllienne nécessite l’apport de C organique (Saccharose, glucose)

Les exigences varies avec l’espèce, la nature du tissus et son état physiologique et
avec le mode de culture et le type d’organogenèse étudié.
 Cours de Culture in-vitro [4éme Année Phytopathplogie]

a) Les macroéléments :

De nombreux minéraux ont été utilisés, certain de ces milieux ont été mis au point
pour des objectifs bien déterminés.

b) Les Microéléments:

Le problème de l’utilisation des microéléments en CIV est complexe et les

recherches systématiques sur ce sujet sont peut nombreux en raison de leurs
difficulté.

Les microéléments sont apporté seulement dans le bute d’enlever toute carence
éventuelle, et afin d’évité également tous risque de toxicité. Les concentrations en
oligoéléments sont faibles.

c) Composés organiques :

* Sucres :

Les tissus en CIV sont largement hétérotrophes en carbone en raison de l’absence

ou de l’insuffisance de l’assimilation chlorophyllienne. Donc il est indispensable
d’ajouté des glucides au m.c

La concentration optimale en sucre pour la croissance des souches tissulaires n’est

pas toujours facile à déterminer.

*Les vitamines :

Diverses vitamines favorisent la croissance des tissus en culture, le manque de

certaine d’entre elle peut être un facteur limitant de l’organogenèse.

*Autres :

- Acides aminées & extrais protéiques cellulaire : bien que les tissus végétal sont
autotrophe à l’azote, il est parfois observer que l’apport d’a.a favorise la
prolifération des cals.

- Acides organiques :

DeGAÏCHIA Houssem Page 3

Rarement utiliser comme source d’énergie dans les m.c. cependant GAMBREG et
SHYLUK (1970) ont observé que des cellules de soja en suspension peuvent se
développer sur un milieu canetant de l’ammonium à condition de fournir des citrates
de malate, fumarate (acide du cycle de KREBS)

-Produits stimulant la composition de cal définie : ou extrants naturel ; résultat

significatif. Extrant de levures, lait de coco.

d) Régulateurs de Croissance & leurs rôles :

1-Auxines et anti-auxines :

*AUXINES :

AIA (acide beta inclolactique) :

Pour des recherches physiologiques. Ils sont sensibles aux sys. enzymatique de
dégradation de l’auxine. Manque de stabilité et oxydation à la lumière. Pour les
multiplications végétales il est souvent remplacer par AIB, AIP

AIB (acide beta inclobutyrique)

AIP (acide beta inclopropionique)

Hum. relativement faible

ANA (acide naphtylocétique) :

Pour provoquer la rhizogenèse, on amplifie parfois des associations AIB, ANA

NOA (acide nephtoxyocetique)

Hum. relativement forte

2, 4-D (acide 2,4 dichlorophenoxyocetyque) Auxine très forte :

Utiliser en association avec les cytokinines ou le lait de coco pour les travaux sur
l’embryogenèse somatique

*ANTI-AUXINES :
 Cours de Culture in-vitro [4éme Année Phytopathplogie]

Action compétitive à l’égard des auxines (acide nophtylsulfopropionique, acide

NI nophtylphtalonine)

Ou perturbation du transport de l’auxine endogène (acide 2,3-5 triodobenzoique

) RAREMENT UTILISER EN CIV

2-Les cytokinines :

-A faible concentration (10-7 à 10-6) : Stimuler la prolifération des tissus en CIV

-A concertation plus élevé (10-6 à 10-5) : Déclencher la néoformation de

bourgeons sur cals

-A forte concentration (10-5 à 10-4) : Favorise la prolifération in vitro des

méristèmes auxiliaire en culture d’apex et pour permettre l’obtention de touffes
de bourgeons ultérieurement fragmentées.

Les cytokenines sont entré ou employés à des faible [ ] dans les milieux les plus

utilisés sont le 6 furfuryl aminopurine et le benzylodémme (6benzyloaminopurime)

3-Les gibbérellines :

Peut utiliser en culture in-vitro. Ont la réputation d’inhiber l’organogenèse et

particulièrement la rhizogenèse

e) Les facteurs physiques de l’environnement :

1-L’état hygrométrique :

Généralement l’obstruction des récipients de culture assure une humidification

suffisante (il n’est pas nécessaire de prévoir un dispositif pour contrôler
l’hygrométrie)

2-La Température :

Généralement constante dans les salles de culture (22-25°C), elle peut être plus
élevée pour les plantes tropicales (27-28°C) ou basse pour certaine espèces (18-
20°C)

DeGAÏCHIA Houssem Page 5

3-La lumière :

*L’intensité d’éclairement :

L’éclairement est fourni par les tubes fluorescents (2000 à 5000 lux)

Chez certaine sp la néoformation des bourgeons exigent la lumière (chou-fleur) et

chez l’adulte elle est favorisée par l’obscurité (Tulipe)

*La photopériode : gle. 16h

III- Application des cultures in-vitro :

On parle de CIV qd des cellules ou un groupe de cellules sont placées hors de

leur environnement qui est la plante.

1-La multiplication conforme :

Reproduire à l’identique un individu et le multiplier en très grand nombre, à partir

de cellules ou d’un fragment d’organe. Elle se réalise à partir de nœudans, de
pousses axillaires. Mis en culture, ces tissu se dvlp et donnent une plante entière
identique à la plante mère

2-La culture de méristèmes :

Ils sont formés de cellules différenciées, à l’origine de tous les tissus de la plante.
Leur culture permet d’obtenir une plante identique à la plante initiale. L’intérêt du
méristème réside dans le fait que se sont des structures intercellulaires INDEMNES
de virus, leur culture donne des plantes saines.

3-Le sauvetage d’embryon :

Les embryons obtenus après fécondation peuvent être prélevé et mis en CIV et
donner un nouvel individu

Le sauvetage d’embryon consiste à prélever un embryon précocement pour le

multiplier in-vitro, soit pour accélérer les cycles végétatives, soit parce qu’il ne peut
pas se développer dans les tissus maternels (Cas de croisement interspécifique)
 Cours de Culture in-vitro [4éme Année Phytopathplogie]

4-L’haplodiploïdisation :

La mise en culture des organes reproducteurs consiste à faire développer des

individus à partir de cellules reproductrices ou gamètes.

5-L’obtention de protoplastes :

Les protoplastes sont des cellules débarrassés de la paroi pectocellulotique, leur

fusion permet de crée de nouvelles variété.

I- Assainissement :

Le problème phytosanitaire posé pour les plante. par les agent phytopathogènes

1-Culture de méristèmes :

Grace aux travaux de WHITE sur la répartition des virus dans les racines de tomate.
Il a remarqué que dans les racines isolées, cultivées in-vitro et provenant de plante
infestées, le nombre de particules virale diminue régulièrement des parties
anciennement formées vers les parties apicales.

« On » retrouver le mm phénomène dans les tiges.

Les méristèmes caulinaires sont beaucoup moins riche en virus que les tissus sous-
jacents, en particulier les ébauches foliaires.

Première expérience sur Dahlia puis la pomme de terre.

L’efficacité de la méthode dépond de la taille de l’explant et du virus

2-la thermothérapie :

Le traitement des végétaux par des températures élevées fut utilisé par KUNKEL
en 1936 pour éliminer l’agent responsable du jaunissement du pêcher
(Probablement un mycoplasme)

Les rameaux, en période hivernal, sont plongés durant 10min en un bain d’eau
chaude à 50°C ou en aire à 35-38°C durant 2-4 semaines.

Mais reste des virus résistant au choc thermique.

DeGAÏCHIA Houssem Page 7

 3- La thermothérapie associée à la culture de méristèmes :

Donne de meilleurs résultats,

Chez le Chrysanthème : plante saine à partir d’explants identiques passe de 5% à

90% pour les témoins et mm 98% selon les cas, après 10 à 30 jrs de traitement à T°
élevée

Pomme de terre → Virus X → Élimination de 50% après 8 semaines de traitement

voir mm 100% après 18 semaines.

Cette technique n’est pas généralisée et elle n’est pas appliquée dans le cas des
virus thermostable.

II- Étapes de développement in-vitro et leurs exigences particulières :

Les organes peuvent soit proliférer de façon anarchique et constituer des amas
cellulaires indifférenciés appelé cals, soit développer des bourgeons et/ou des
racines donnant naissance par voie directe à des plantules viables.

1-Multiplication et allongement :

L’étape la plus importante, l’objectif est de produire le nombre max de plantules

utilisables à chaque subculture.

Dans de nombreux cas, il suffit de laisser grandir suffisamment les plantules sur le
milieu de multiplication avant de les passer en enracinement, si tel n’est pas le cas
on permet leur allongement on les posant sur un milieu dépourvue de régulateur de
croissance ou additionné de GA3

2-Enracinement :

Ce n’est pas tjr une étape facile, mais on apporte des modifications sur le milieu de
culture de base en vue de l’enracinement :

*Apport d’une auxine seul (nature et concentration à déterminer pr chq sp)

*Polyphénol bon stimulateur

*Délutions des sels inorganiques (KI) jusqu’à 1/2 des valeurs des MS
 Cours de Culture in-vitro [4éme Année Phytopathplogie]

*Addition d’absorbant tel que le charbon actif

3-Acclimatation :

Les facteurs les plus importants sont le substrat et l’atm.

Un spécialiste qui choisira le types de compost (sol) et les conditions de

l’environnement (T°, Hum, Lum.)

*L’application d’un fongicide en spray pour éviter l’attaque des jaunes plantules.

*Eviter la fanaison par perte de d’eau excessive de ces jeunes plantules (le sys
vasculaire et la cuticule foliaire ne sont pas développés

*Les trains sont recouverts soit d’une plaque soit placer sous tente durant 15jrs.

IV-Les haplométhodes :

Production de plante haploïde

1-Haploïdes spontanés :

Se rencontrent avec des fréquences faibles. On les distingue par deux méthodes :

a- Le tri des grains polyembryonnée (le plus souvent deux embryon).

b- Marquage génétique

Le 1er haploïde repéré dans une graine à deux embryon a été signalé chez le riz,
aussi chez le lin, le cotonnier, le blé dure, le blé tendre.

Ces embryons doubles semble provenir du développement d’une devisions

prématuré de l’oosphère avant fécondation.

2-Haploïdies induit in-situ :

Consiste à augmenté les phénomènes spontanés. L’induction d’haploïdies par

traitements physiques (irradiation du pollen) ou chimique (Colchicine…) a été
signalée chez le maïs, le datura.

DeGAÏCHIA Houssem Page 9

3- Haploïdies induit in-vitro :

La culture de gamétophytes femelles in-vitro fait appel à des mécanismes mal

connus que l’endogènese, toutes ses potentialités n’ont pas encor été exploitées.
 Cours de Culture in-vitro [4éme Année Phytopathplogie]

Important à retenir
Les milieux de cultures :

1. MS : Murashing et Stroog

2. Gonborj

3. Haller

4. Wite

5. Gantheret

Dans les milieux de culture on met :

Microéléments + Macroéléments + fer EDTA + Vitamines (Morel) + Saccharose (20g)

+ Agar (8g)

*Le milieu solide pour :

-Les Micro-proporation

-Callogénese

*Le milieu liquide pour :

-Embryogenèse somatique (tissus de la plt , même allure que l’embryon fécondé)

*Organogenèse

Indice de Auxine/cytokenine (2-4D /AIA) :

- Supérieur à 1 : Pour les bourgeons

- Inférieur à 1 : Pour les racines

-Égales à 1 : pour la callogenèse

Travailler sous la hotte pour les travaux de repiquage.

DeGAÏCHIA Houssem Page 11