TD 1 

: LES MILIEUX DE CULTURES

I- DEFINITION
Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de bactéries, de
levures, de moisissures afin de permettre leur étude. En principe, les cellules trouvent dans ce
milieu les composants indispensables pour leur multiplication en grand nombre, rapidement,
mais aussi parfois des éléments qui permettront de privilégier un genre bactérien ou une
famille.

II- LA COMPOSITION DE BASE

Un milieu de culture se compose d'une base (eau, les sels minéraux, les nutriments
(constitutifs et énergétiques...), ainsi que d'un indicateur coloré de pH ou de réaction d'oxydo-
réduction pour permettre de formuler des hypothèses sur le genre. Ces milieux peuvent se
présenter sous forme:
- Liquide : bouillons de culture en tubes ou en flacons. La croissance se traduit
par un trouble
- Solide: Les milieux solides sont le plus souvent des milieux gélosés en boîte de
Pétri. La croissance se traduit par des colonies.

Pour solidifier le milieu on utilise fréquemment la gélose ou agar-agar, un polymère de sucre

tiré d'une algue rouge présentant la propriété de former avec l'eau un gel solide si la
température est inférieure à 60°C.

III- CLASSIFICATION DES MILIEUX DE CULTURE

1- Selon leur composition

Les milieux naturels ou empiriques

Les milieux synthétiques
Les milieux semi-synthétiques

1-1-Milieux de cultures naturels ou empiriques

Un milieu de culture dit empirique est un milieu dont on ne connaît pas exactement la
composition. Ainsi, dans le milieu type cœur-cervelle, il y a de l'eau, de l'agar-agar, de
l'hydrolysat de cœur et de cervelle sans que l'on en connaisse les aspects qualitatifs et
quantitatifs. Il sera donc utilisé uniquement pour la croissance des bactéries. Il n'a pas d'effet
sélectif.

1-2- Les milieux synthétiques

Sont composés de substances purifiées présentes en quantité bien précises. Leur

composition est donc connue de façon précise à la fois qualitativement et quantitativement.

1-3-Les milieux semi-synthétiques

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 Ces milieux sont obtenus en ajoutant une substance naturelle à un milieu synthétique
(ex : extrait de levures). Leur composition est donc parfaitement connue que pour certains
composés chimiques. Ils sont très nombreux et très utilisés actuellement.

2- D’après leur utilisation

2-1- Milieu minimum

Un milieu minimum ou milieu défini est un milieu comportant les éléments

chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne, sous une forme utilisable par
des bactéries n'ayant pas d'exigence particulière.

 Composition d'un milieu minimum:

o Une source de carbone et d'énergie, généralement le glucose.
o Une source de potassium et de phosphore: K2HPO4
o Une source d'azote et de soufre: (NH4)2SO4
o Une source de magnésium: MgCl2
o Une source de calcium: CaCl2
o Une source de fer: on emploie le citrate de fer (C6H5FeO7) (le citrate a pour
rôle de maintenir le fer en solution)
o Une source d'oligo-élements: sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti
o Une source d'eau, indispensable à toute forme de vie: on utilise l'eau distillée
(stérile)
o Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct voire optimum: KH 2PO4
par exemple.

En l'absence de l'un de ces composants, les bactéries ne se développent pas, car elles
ne peuvent synthétiser ces produits.

2-2- Milieux usuels dits de base

On regroupe sous ce terme les milieux de composition et de préparation assez simple. En

général peu couteux et permettant le développement d’une grande variété de
microorganismes.
En bactériologie médicale on utilise souvent des milieux à base d'extrait de viande
pour la culture de la plupart des microbes commensaux ou pathogènes de l'homme et des
animaux. Les milieux les plus utilisés sont le bouillon nutritif et la gélose nutritive.
En bactériologie agricole on utilise des milieux à base de lait, d'extraits végétaux, etc.

2-3-Milieux de cultures sélectifs

Les milieux de culture dit sélectifs permettent uniquement la culture de certains genres
de micro-organismes. Pour cela on ajoute des éléments qui inhibent la croissance des micro-
organismes indésirables comme le chlorure de sodium à forte concentration, le thiosulfate de
sodium, le cristal violet ou certain antibiotiques etc.
Les éléments ajoutés sont sélectionnés selon les caractéristiques du micro-organisme
recherché. Ces milieux sont utilisés pour l'analyse d'un prélèvement polybactérien.

Exemples de milieux sélectifs :

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 milieu S-S : il ne permet la croissance que des Salmonelles
 milieu de Sabouraud : il permet la pousse des mycètes.
 gélose Kanamycine - Vancomycine, dite "Kana-Vanco" ou KV : elle empêche la
pousse des bactéries à Gram positif et de la plupart des entérobactéries. Sur ce milieu,
poussent préférentiellement des bactéries anaérobies strictes.

2-4-Milieu de culture enrichi

Ils contiennent, outre les composants de base, des composants indispensables aux
bactéries, que celles-ci ne peuvent pas synthétiser. Ce sont des milieux utilisés pour
l'obtention des bactéries dites exigeantes. Par exemple :
Les milieux au sang frais (riche en nutriments divers): Gélose au sang frais ou cuit.
Les milieux avec du sérum, du jaune d'œuf : Gélose Baird Parker (BP).

2-5- Les milieux d’enrichissement

Ces milieux permettant de favoriser la croissance d’une espèce en faible quantité dans
un échantillon.

2-6- Les milieux d'identification

L'identification des bactéries est surtout basée sur l'étude de leurs propriétés
biochimiques. Ceci par la culture de la souche bactérienne sur un grand nombre de tubes de
milieux spéciaux (galerie bactérienne).

On observe  la modification des milieux soit directement, soit grâce à des indicateurs
chimiques, puis on rassemble tous les renseignements obtenus sous forme d'une fiche
signalétique qui permet d'établir l'identité de la bactérie en cause.

2-7- Milieux d'isolement

Ces milieux ont une consistance ferment (l’agar-agar). Permettent d'obtenir les
bactéries, contenues dans un produit naturel, à l'état de culture pure, par étalement en surface
de ces géloses. Peuvent être:

- Les milieux de base usuels précédemment cités.

- Les milieux de base enrichis de produits biologiques: sang, suppléments poly vitaminiques,
sérum. Ces milieux enrichis facilitent l'isolement des bactéries fragiles et exigeantes à partir
des pro- duits pathologiques.

2-8- Les milieux de conservation

Milieux pauvres qui maintiennent les bactéries dans un état de vie ralentie.

2-9-Milieu différentiel
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 Le milieu de culture dit différentiel ou indicateur' permet de distinguer deux types de
microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu utilise certaines
caractéristiques biochimiques des microorganismes en présence de certains nutriments ou
marqueurs (tel que le rouge neutre, rouge de phénol, l'éosine ou le bleu de méthylène). On
retrouve :

 la Gélose Éosine Bleu de Méthylène (EMB), qui différentie la fermentation du

lactose de celle du saccharose
 la gélose MacConkey (MCK), qui différentie la fermentation du lactose
 la Gélose Chapman (MSA), qui différentie la fermentation du mannitol.

IV-UTILISATION DES MILIEUX DE CULTURES

Les milieux de culture utilisés peuvent être obtenus de différentes façons. Ils peuvent
être :
- Achetés, conditionnés, prêts à l'emploi.
- Préparés à partir des différents ingrédients entrant dans leur formule.
- Préparés à partir de milieux secs déshydratés.
- Préparés, juste au moment de l'utilisation sous leur forme définitive.

Certains milieux exigent, juste avant leur emploi, l'addition de substances périssables,
d'autres, un conditionnement n'autorisant qu'un court délai de conservation, etc.

V-PREPARATION CLASSIQUE D’UN MILIEU

1- Répartition
Les milieux sont les plus souvent répartis avant leur stérilisation, cette répartition est
effectuée, suivant l'équipement du laboratoire.

2- Stérilisation
La stérilisation est effectuée le plus souvent à l'autoclave à 115- 120° C , 20 min.

  3- Après la stérilisation

Certains milieux gélosés doivent être mis à refroidir en position inclinée de façon à
obtenir une pente après solidification. Les tubes de milieux de culture sont stockés en position
verticale dans un endroit frais et obscur.