1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD module de BIB

inSérie n°01
EXERCICE 01 :

On réalise la carte de restriction d'un fragment amplifié par PCR avec les enzymes
de restriction EcoRI, BamHI, XbaI et NcoI. Les tailles des fragments obtenus sont
(en kilo paires de bases):

E B N X E-X E-N X-N

0,3 0,3
0,4 0,8 0,3 0,4
0,4 0,7
1,4 1,8 1 1,5 1
1,1 0,8

 Donner la carte de restriction du fragment amplifié par PCR.

EXERCICE 02 :

Un plasmide portant les gènes Kan r Ampr (Kanamycine et Ampicilline) est traité
par l'enzyme Bgl II, dont le site de coupure est localisé dans le gène Amp. Ce
plasmide est lié en présence d'un gène étranger de drosophile digéré par la Bgl II.
Puis les plasmides circulaires obtenus sont utilisés pour transformer E. coli.

 Quel antibiotique mettez-vous dans le milieu pour sélectionner les colonies

contenant un plasmide?
 Quels types de phénotypes résistants aux antibiotiques trouvez-vous dans
le milieu ?
 Quel sera le phénotype des colonies contenant un plasmide recombinant ?
 Combien de fragments d’ADN vont être produits par une enzyme de
restriction que l'on fait agir sur un plasmide (molécule circulaire) possédant
1 site pour cette enzyme ? Sur l'ADN linéaire d'un bactériophage possédant
deux pour cette enzyme ?

EXERCICE 03 :

On clone un fragment d'ADN génomique Eco RI-Bam HI de 2 kb d'Arabidopsis

thaliana aux sites Eco RI et Bam HI du plasmide pBLQ54 (voir schémas ci-
dessous).

1
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EcoRI

HindIII 0
BamHI
5.5
1
PvuII 5
pBLQ54
(6kb)
2
4 2.5 HindIII

PvuII
PvuII

SstI EcoRI PvuII BamHI HindIII

0 0.5 1.5 2.5 4

Région de l'ADN génomique contenant le fragment Eco RI-Bam HI de 2 kb:

1. Présentez un schéma du plasmide recombinant et positionnez les sites de
restriction sur ce schéma.

2. Pour contrôler le résultat du clonage, on fait une analyse par restriction du

plasmide recombinant en utilisant les enzymes de restriction HindIII et
PvuII séparément et en double digestion, puis en réalisant une
électrophorèse en gel d'agarose. Schématisez ce que l'on doit observer à
l'issue de l'électrophorèse pour les digestions enzymatiques en indiquant en
clair les tailles des différentes bandes obtenues.

Enfin pour s'assurer du résultat, on réalise un transfert sur membrane de

nitrocellulose (Southern blot) à partir du gel de la question 2. La membrane
est hybridée avec une sonde constituée du fragment Eco RI-Bam HI d'ADN
génomique d'A. thaliana marqué au 32P.

3. Rappelez brièvement le principe d’hybridation moléculaire de type

Southern.
4. Parmi les fragments générés lors des digestions du plasmide pBLQ54
recombiné par les deux enzymes de restriction (Hind III et Pvu II), à quel(s)
fragment(s) s'hybridera la sonde?

2
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Série n°02

EXERCICE 01 :

Soit les enzymes de restriction a, b et c que l’on agir sur un plasmide de 4000pb.
L’électrophorégramme est représenté dans la figure ci-dessous Positionnez les
a b c ab ac bc
sites de restriction sur le plasmide.
4000pb
500 3800pb
3000pb

1000 2000pb

1400pb
4000pb 900 1000pb

900pb

500 500pb
200
200pb
900

EXERCICE 02 :

Un fragment d’ADN génomique de levure de 1500 pb, contient la séquence

codante d’un gène (topo) codant une topoisomérase (figure 1). En vue
d’exprimer cette enzyme dans la bactérie E.coli, sa séquence codante est clonée
dans le vecteur plasmidique pBR322 (figure 3).

BamHI HindI EcoRI

300pb 1200pb

Figure 1 Carte de restriction du Figure 2 Séquence des sites de restriction

fragment d’ADN génomique de levure
contenant le gène topo

3
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AmpR
AmpR

pBR322 (2800pb)
HindI
300pb TetR
TetR BamHI Le gène topo
ORi
200pb
ORi
EcoRI

Figure 3 Carte de restriction du Figure 4 : Plasmide recombinant contenant

plasmide pBR 322. le gène topo

Question 1 :

A. Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez

les clones recombinants
1. Quelle est le rôle de la présence du fragment ORI.
2. A l’aide des figures ci-dessus, mentionner les endonucléases de
restriction permettant l’insertion du gène topo dans le vecteur
plasmidique pBR322? Justifier. Quel est le type d’extrémités
générées ?
3. Quelle est la fréquence statistique des sites de restriction pour les
enzymes BamHI, EcoRI, HindI
Question 2 :
Le fragment d’ADN génomique et le vecteur pBR322 digérés sont alors mélangés
et mis en présence de l’ADN ligase du bactériophage T4. Quelles sont les
différentes molécules obtenues à l’issue de cette ligation ?
Question 3:
1. Positionner et numéroter, si besoin, les sites de restriction HindIII,
EcoRI et BamHI sur le schéma du plasmide recombinant dans la
feuille réponse. Indiquer la taille du plasmide recombinant.
2. Schématiser le profil électrophorétique des fragments issus de la digestion de ce
plasmide par chacune des enzymes, par les doubles digestions (BamHI + HindI ),

4
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(BamHI + EcoRI ) , (EcoRI + HindI) et par la triple digestion
(BamHI+EcoRI+HindI)

EXERCICE 03 :
On souhaite étudier la fonctionnalité d’un gène M d’une bactérie. Pour cela, on essaie de cloner au
site EcoRI du vecteur plasmidique pBR330 (voir schéma) un fragment Eco RI-Eco RI d'ADN
génomique de la bactérie d’intérêt.

a- Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez les

clones recombinants.

Un plasmide recombinant contenant le gène M (appelé pBM1) est digéré parles enzymes de
restriction Bam HI et Eco RI. Après migration et séparation des fragments d'ADN
sur gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium, on obtient les profils de restriction
suivants:

 Donnez la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.

5
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Série n°03

EXERCICE 01 :

Soit un fragment d’ADN sur lequel sont représentés l’emplacement de

certains sites de restriction. Les zones d’hybridation correspondant à
différentes sondes radioactives (utilisées à raison d’une sonde par
expérience) sont celles qui correspondent à la projection sur l’ADN des
zones délimitées par les rectangles hachurés. Les différents transferts de
Southern réalisés sont révélés par autoradiographie, (on considérera que
quelle que soit la longueur de la zone de complémentarité entre la sonde et la
cible, il y a hybridation).

1. Quelle(s) sonde(s) permettrai(en)t de révéler sur l’autoradiographie,

deux bandes distinctes (correspondant à des poids moléculaires
différents) après le transfert de Southern de cet ADN coupé à la fois par
HindIII et BamH1.
2. Rappeler brièvement le principe de la technique d’hybridation des acides
nucléiques

EXERCICE 02 :
On dispose de l’ADNc (ADN complémentaire) de l’insuline humaine, du plasmide
pBR322, de bactéries hôtes sensibles à l’ampicilline (AMP) et à la tétracycline
(TET) ainsi que deux enzymes de restriction : PstI et BamHI.

6
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A la fin de cette expérience, nous obtenons trois types de clones
bactériens dont les caractéristiques sont regroupées dans le tableau suivant :

1/ Donner les principales étapes de cette expérience ?

2/ Interpréter les résultats regroupés dans ce tableau en précisant le clone positif
?
3/ Quels sont les avantages de la synthèse de l’insuline par génie génétique ?

Série n°04
EXERCICE 01 :

Les clones génomiques et l'ADNc d'une enzyme phosphatase ont été isolés.
D'après les résultats suivants, les caractéristiques structurales du gène et de son
transcrit peuvent être déterminées.

Le fragment d'ADNc a été retiré du plasmide et ses extrémités ont été marquées
au 32P. Il a ensuite été digéré par des enzymes de restriction. Les analyses
donnent les résultats suivants:

a. Déterminez la carte de l'ADNc.

Le fragment d'ADN génomique est extrait d'un clone de phage lambda par
digestion Eco RI, puis ses extrémités sont marquées au 32P. Il a ensuite été
digéré par des enzymes de restriction. Les analyses donnent les résultats
suivants:

7
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b. Dessinez la carte génomique du fragment, en positionnant les sites de

restriction.

c. Quelle part du gène représente le fragment génomique de 3,0 kb?

d. Une sonde d'ADNc marquée hybride avec les fragments génomiques de 3,4 et
2,2 kb. Le fragment Taq I de 1,2 kb hybride avec le fragment génomique de 3,4
kb. Si le gène de la phosphatase est présent en simple copie, à quel(s) fragment(s)
génomique(s) s'hybridera le fragment Taq I de 1,1 kb?

EXERCICE 02 :

Dans le but d’étudier l’expression du gène nemaxe, des chercheurs ont préparé
un ADNc de ce gène. Cet ADNc a été obtenu par PCR.
1. Résumez brièvement le principe de la PCR.
Pour analyser cet ADNc, les chercheurs voudraient le cloner dans un vecteur de
clonage. Ils ont à leur disposition deux vecteurs pGEM 7ZF et pYAC (figure 1) et
un hôte récepteur bactérien.
2. De quel type de vecteurs s’agit-il ? Justifiez.
3. Le vecteur pYAC est dit vecteur navette, expliquez pourquoi ?
4. Quels avantages présente le clonage dans le vecteur pYAC ?
5. A quoi correspondent les séquences suivantes annotées sur les vecteurs ?
 ColE1 ori  Rep (pMB1)
 bla (Apr) et Tet (Tcr)  TEL
 Lac Z  ARS

Les chercheurs ont décidé d’utiliser le vecteur pGEM 7ZF. Vous réalisez une
digestion par l’enzyme XhoI (C/TCGAG) sur le vecteur pGEM 7ZF. Parallèlement,
vous pouvez préparer l’insert nemaxe , soit par une digestion Sau3A ( /GATC),
soit par une digestion SalI (G/TCGAC).
1. Qu’est-ce qu’un ADNc ? Expliquer brièvement comment obtenir de l’ADNc.

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2. Expliquez pourquoi les chercheurs ne peuvent pas utiliser de l’ADN
génomique.
3. Quel enzyme choisissez-vous pour préparer votre insert et le cloner dans le
vecteur pGEM 7ZF?
4. Quel traitement pouvez-vous effectuer afin que le vecteur ne se
recircularise pas ? Expliquez le principe
5. Dites comment vous pouvez choisir les cellules recombinées.
Après mise en culture, les bactéries sont lysés et l'ADN plasmidique est purifié.
Cet ADN est digéré par l'enzyme de restriction SalI et par double ou triple
digestion en associant les enzymes de restriction SalI , EcoRI et HindIII.
Ces différentes digestions produisent les fragments suivants :

Enzyme (s) utilisée Nombre de Taille des fragments obtenus

(s) fragments
obtenus
EcoRI 1 4900 pb
SalI 2 3100 pb + 1800 pb
HindIII 2 2700 pb + 2200 pb
EcoRI + SalI 3 2800 pb + 1800 pb + 300 pb
HindIII + EcoRI 3 2700 pb + 1400 pb + 800 pb
SalI + HindIII 4 1700 pb + 1400 pb + 1300 pb + 500 pb

a. Comment peut-on visualiser les différents fragments obtenus à l'issue des

différentes digestions ? Vous pourrez illustrer vos propos à l'aide d'un schéma.
b. b) Quelle est la carte de restriction du fragment d'ADN cloné ? Vous ferez un
schéma et argumenterez votre analyse.

Figure 1

9
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Série n°05
EXERCICE 01 :
Un séquençage d’une région d’ADN est effectué par la technique de Sanger à partir de deux
échantillons d’ADN. Deux autoradiogrammes de gels de séquence sont présentés
- Rappelez le principe de séquençage de type Sanger.
- Comment visualiser les fragments d’ADN néosynthétisés ?
- Donnez la séquence du brin matrice des deux échantillons d’ADN.
- Quelle information vous apporte l’analyse comparative de ces 2 autoradiogrammes ?

A T G C A T G C

EXERCICE 02 :

Un fragment d’DNAX a été séquencé par la méthode de Sanger. Le résultat obtenu

est représenté par la figure ci dessous. Le sens de la migration électrophorétique
est signalé par la flèche orientée vers le bas
Question 1: Que représentent les bandes visibles sur l'autoradiogramme ?
Question 2: Où se situe la différence entre le ddATP et le dATP ?
Question 3: Déduire à partir de cette figure la séquence nucléotidique du brin
matrice correspondant au DNAX.

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EXERCICE 03 :

L'ADN plasmidique pBR 607 est circulaire et double brin et a une taille de 2,6 Kb
Ce plasmide porte deux gènes qui lui confèrent la résistance à la tétracycline
(TET-r) et à l'ampiciline (Amp-r) dans les bactéries.
Cet ADN a un site unique pour chacune de ces enzymes : ECoRI, Bam Hl, Hind
III, Pst I et Sal 1.
En clonant dans EcoRI aucune de ces résistances n'est affectée. Par contre en
clonant dans Bam Hl, Hind III et Sal 1 la résistance à la tétracycline est
supprimée, en clonant dans Pst I c'est la résistance à Tampicilline qui l'est.
La digestion avec certaines de ces enzymes donne les fragments représentés dans
le tableau suivant .
Enzymes in mixture Molecular welghis of fragments
EcoRI, Pstl 0.46, 2.14
EcoRI, BamHI 0.2. 2.4
EcoRI. HLnd III 0.05, 2.55
EcoRI, SalI 0-55. 2.05
EcoRI, BamHI, Psil 0.2,0.46, 1.94
 Positionnez les sites les uns par rapport aux autres.

Série n°06
EXERCICE 01 :

Ou fait agir sur un plasmide deux enzymes de restriction afin de rechercher les
sites de coupures de ces deux enzymes et de construire la cartes de restriction
correspondantes ainsi que la carte combinée.
La digestion terminée, chaque lot d'ADN est soumis à une électrophorèse en gel
d'agarose qui sépare les fragments d'ADN selon leur taille
Le document suivant donne les électrophorèses après des digestions simples et
multiples.
1. Quel est la taille du plasmide en paires de bases ?
2. Combien possède-t-il de sites de coupure pour l'enzyme EcoR I ?
3. Pour l'enzyme BamHI ?
4. Ordonnez les différents fragments obtenus les uns par rapport aux autres.

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EcoR I Bam HI EcoR I + Bam HI

17.00pb

16.75pb
15.15pb

13.20pb

08.15pb

07.50pb 07.50pb

07.00pb
05.70pb 05.70pb

05.00pb

03.60pb 03.60pb

02.50pb

EXERCICE 02 :

On effectue un transfert de Southern pour lequel une sonde s’hybridera avec une séquence
minisatellite de 60 pb. L’ADN d’un patient est coupé à l’aide des enzymes de restriction Sal I, Hind
III et Xho I. Sur le schéma ci-dessous est représenté l’emplacement où devrait se fixer la sonde ainsi
que ceux des sites de restriction des enzymes citée.

Quel est la figure parmi les suivantes, qui correspond au cas où le patient possède ce minisatellite ?

Quel est la figure parmi les suivantes, qui correspond au cas où le patient possède ce minisatellite ?

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EXERCICE 03 :

Caractérisation de la nature de la mutation par séquençage.

On réalise, selon la méthode de Sanger et Coulson, le séquençage du brin d'ADN porteur de la
séquence B mutée 5'-TGGCCT-3'.
A quel profil électrophorétique vous attendez-vous ?
N.B. : la flèche indique le sens de migration sur gel

Série n°07

EXERCICE 01 :
L'une des six cartes de restriction représentées ci-après est compatible avec le
profil des bandes (représenté juste en dessous), obtenu après digestion par
plusieurs endonucléases de restriction.
Les enzymes qui ont été utilisées sont indiquées.

1. Analysez le profil des bandes sur le gel et sélectionnez la carte correcte :

expliquez votre raisonnement.

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2. Dans un Southern blot préparé à partir de ce gel, les bandes en rose sont
hybridées au gène pep. Où est situé le gène pep ?

Série n°08
EXERCICE 01:

Un microgramme du fragment d’ADN double brin dont la séquence est indiquée ci-dessous est
utilise dans 20 réactions enzymatiques différentes.
5' CGGATCCAGA AAAGATCCGC TTTCCTAACC TCGATTGATC ATTTTATTAT3' Au vu
des expériences réalisées, compléter de façon précise le tableau ci-joint.

N° Expérience Résultats obtenus

1 Digestion du fragment par
HindIII : (A/AGCTT)
2 Digestion du fragment par
TaqI : (T/CGA)
3 Digestion du fragment par
Sau3AI : (/GA TC)
4 Digestion du fragment par
NlaIV : (GGN/NCC)
5 Digestion du fragment par les 4 enzymes
citées ci-dessus
6 Digestion du fragment par la RNase H
7 Digestion du fragment par la
nuclease S 1
8 Digestion du fragment par l'exonuclease
III d'E. coli a
9 Digestion du fragment par la DNase I
10 Action d'une DNA ligase
11 Action d'une CpG methylase
12 Action d'une CpG methylase puis
digestion par TaqIb
13 Digestion par TaqI puis ajout d'une DNA
ligase
14 Action d'une CpG methylase puis
digestion par AciI (C/CGC)c
15 Digestion par TaqI et ajout d'une DNA
polymerase et des 4 dNTPs
16 Digestion par TaqI et ajout d'une DNA
polymerase et de dCTP
17 Digestion par TaqI puis digestion avec la
nucléase S 1 puis redigestion par Taql
18 Digestion par TaqI puis digestion par
Exonuclease I d 'E.colid
19 Ajout d’une 5' -polynucleotide kinase en
presence d'a32P-dCTP
20 Ajout d'une ARN polymerase et des 4
rNTPs

14
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a : l' exonuclease III d 'E. coli catalyse l'élimination de nucléosides
monophosphates sur de I' ADN double brin dans le sens 3'->5'
b : TaqI est une enzyme de restriction insensible a la methylation des cytosines
c : AciI est une enzyme de restriction sensible par la methylation des cytosines
d : l'exonuclease I d'E. coli catalyse l'élimination de nucléosides monophosphates
sur de l' ADN simple brin dans le sens 3'->5' .

EXERCICE 02 :

MspI et HpaII sont deux endonucléases qui clivent le même motif palindromique
CC/GG. Il est par ailleurs démontré que la méthylation des cytosines qui
précèdent les guanines protège les sites CC/GG de l’attaque de HpaII et non celle
de MspI.
1/ Comment appelle-t-on les enzymes HpaII et MspI ?
L’étude de deux fragments d’ADN (A) et (B) isolés à partir de deux tissus
différents d’un même individu, est réalisée à l’aide de ces deux enzymes.
L’électrophorégramme ci-après est obtenu après coloration au BET des sous
fragments de digestion des deux ADN, préalablement séparés par électrophorèse.

2/ Que peut-on dire des ADN A et B ? Justifiez votre réponse.

3/ Quelle signification physiologique peut revêtir le constat fait à la question 2 ?
En vue de cartographier les fragments d’ADN A et B, ils sont marqués avec le (y32
p) ATP, puis digérés par les enzymes de restriction.
L’autoradiogramme obtenu est présenté ci-dessous :

4/ Donnez la cartographie des ADN (A) et (B).

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EXERCICE 03 :

Vous disposez d'un brin d'ADN à séquencer (matrice), d'une amorce, d'ADN
polymérase, des quatre 2'-désoxyribonucléotides (dXTP) et d'un jeu des différents
2',3'- didésoxyribo-nucléotides (ddXTP). L'amorce est radiomarquée par du
phosphore radioactif 32P.

L'ADN matriciel à séquencer ACGTAATCGC—comporte, à son extrémité 3', une

séquence supplémentaire (représentée ici par un segment de droite en pointillé)
sur laquelle l'amorce va s'hybrider, créant ainsi le site d'initiation de l'ADN
polymérase.

1. Résumez brièvement le principe de la méthode en indiquant le rôle du

didésoxyribonucléotide.
2. Compléter le tableau en indiquant la composition des différents milieux
réactionnels et, pour chaque milieu, le type et la taille des fragments
néosynthétisés.

3. Sur le gel ci-dessous, représenter la taille des fragments néosynthetisés

dans

chaque milieu réactionnel (utiliser l'échelle de taille représentée à gauche

du schéma)
4. Reporter, à droite, la séquence du brin synthétisé puis la séquence
recherchée, en indiquant le sens de lecture des séquences établies.

16
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Série n°09
EXERCICE 01:

Un premier travail est réalisé sur l’ADN double brin schématisé ci-dessous
(Figure 1). Pour ce travail, vous disposez de deux sondes: une sonde X de 250 pb
et une sonde Y de 200 pb. Chacune de ces sondes reconnait une région
particulière de ce fragment d'ADN

. (Figure 14). A l'aide de ces sondes, différents Southern-blots sont réalisés.

Figure 14 : Les distances ci-dessus sont exprimées en paires de bases (Pb). B :

site de restriction BamH I ; E : site de restriction EcoR I ; H : site de restriction
Hind III ; P : site de restriction Pst l

1. Quel(s) résultats) devriez-vous obtenir en digérant l’ADN, simultanément, par

les .enzymes BamH I, Hind III et EcoR I et en utilisant la sonde X ?
2. Quel(s) résultats) devriez-vous obtenir en digérant l’ADN, simultanément, par
les enzymes BamH I et EcoR I et en utilisant la sonde Y ?
3. Représenter une sonde qui vous permettrait de visualiser tous les fragments
obtenus après la digestion enzymatique par les 3 enzymes (BamH I, Hind III et
EcoR I) simultanément.
4. Proposer deux stratégies permettant d'amplifier la région A.
Un southern-blot est en suite réalisé en digérant de l'ADN génomique de 3
patients par l'enzyme de restriction EcoR I et en utilisant une sonde A1 (Figure
15). Cette représentation permet d'observer l'existence d'un site de restriction
EcoR I polymorphe.

17
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5. Représenter un fragment d'ADN (localisation des sites de restriction

polymorphes ou non, positionnement sur ce fragment d' ADN de la sonde AI)
permettant d'expliquer ces 3 résultats.

6. Même question, mais la sonde utilisée est la sonde B (Figure 16).

7. Même question, mais la sonde utilisée est la sonde C (Figure 16).
8. Même question, mais la sonde utilisée est la sonde D (Figure 16).
9. Une étude est réalisée sur un individu de sexe masculin. Une séquence d’ADN
localisée sur le chromosome X présente 2 sites EcoRI polymorphes proches l'un
de l'autre :E1 et E2) (figure 17). Apres digestion avec l'enzyme EcoRI et
hybridation avec la sonde E, quels fragments pourront être visualises dans les
cas suivants : a) sites El et E2 absents; b) sites El et E2 présents; c) site El
présent et site E2 absent; d) site El absent et E2 présent?

10. Les résultats auraient-ils été identiques si la même étude avait été réalisée
sur un individu de sexe féminin ?
EXERCICE 02 :

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Un des buts de l'exercice est d'amplifier par PCR la séquence d'ADNc reportée
dans la figure 19.

Figure 19. Séquence partielle de l'ADNc normal.

La séquence de l'exon 2 correspond à la séquence indiquée en gras et soulignée

1. Parmi les amorces indiquées ci-dessous, choisir la seule paire qui pourrait
vous permettre de réaliser avec succès votre amplification. Préciser la taille de
l'amplicon attendu.

Amorce 1 : 5' GACAATATCACTGACCAGTT3'

Amorce 2: 5' AACTGGTCAGTGATATTGTC3'
Amorce 3: 5'GCAA3’
Amorce 4: 5'CTGTT3’
Amorce 5: 5'GACAATATCACTGACCAGTT3’
Amorce 6: 5'AACTGGTCAGTGATATTGTC3’
Amorce 7: 5'GACAA3’
Amorce 8: 5'CTGTT3’
Amorce 9: 5'AGTTCTGCAGTTTCC3’
Amorce 10: 5'GGATGTTAACTGCAGAACT3’
Amorce 11: 5'CATCC3’
Amorce 12: 5'GGATG3’
Amorce 13: 5'AGTTCTGCAGTTAACATCC3’
Amorce 14: 5'GGATGTTAACTGCAGAACT3’
Amorce 15: 5'CATCC3’
Amorce 16: 5'GGATG3’

2. Préciser si cette amplification PCR aboutirait aux mêmes résultats en utilisant

I' ADN génomique du patient a la place de I' ADNc.
3. A part les amorces, préciser l‘ensemble des réactifs nécessaires pour réaliser
cette amplification.

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4. Indiquer a l'aide d'une flèche sur la figure 19 (s'ils existent) les sites de coupure
des 3 enzymes de restriction indiquées ci-dessous.
NotI: 5'GC/GGCCGC3'; Pstl: 5'CTGCA/G3'; AluI: 5'AG/CT
5. Le produit de PCR obtenu ci dessus est ensuite digère simultanément par les
enzymes Pstl et AluI. Définir le nombre de fragments obtenus, déterminer la taille
de chacun de ces fragments et représenter les extrémités de chacun de ces
fragments.

EXERCICE 03 :

Un plasmide recombinant (plasmide X), d'une longueur de 10000 pb, contient un

segment d'ADNc codant pour le peptide FCMDQLA (voir liste des acides amines).
1. Parmi les enzymes de restriction proposées ci-dessous, laquelle, s'Il y en a,
coupera définitivement ce segment d’ADNc (N représente un nucléotide
quelconque). (
AluI : 5’AGCT3’ ; Sau96I : 5’GGNCC3' ; HindIII : 5’AAGCTT3'
2. La digestion du plasmide X par différentes enzymes de restriction aboutit aux
résultats indiques ci-dessous. Etablir la carte de restriction de ce plasmide.

Le plasmide X n'ayant la carte de restriction souhaitée, un autre plasmide est

utilise: le plasmide B. Le plasmide B dérive du plasmide A en raison de l'insertion
d'un fragment d’ADN de taille malheureusement inconnue. Pour connaitre la
taille de cet insert, vous décidez de digérer 100 ng de chacun de ces 2 plasmides
par une enzyme de restriction puis d'analyser la taille des fragments de
restriction sur un gel d'agarose a 3% après coloration du gel avec du bromure
d'ethidium. Ne connaissant pas les concentrations des solutions de plasmides A
et B, vous décidez de les déterminer a l'aide d'une lecture spectrophotométrique a
260 om et 280 om. Trois dilutions sont testées : 1/25, 1/100, 1/400. Les
résultats obtenus sont indiques dans le tableau 1.

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3. Quelles sont les concentrations (approximatives) d’ADN des solutions A et B ?

Une fois les concentrations déterminées, la digestion enzymatique est réalisée.
Les résultats de l'électrophorèse sont schématisés dans la figure 12. Les
distances de migration de chacun des fragments par rapport au puits de dépôt
sont indiquées dans le tableau 2.

Tableau 2. Distance de migration (en

mm) des différents fragments (classement
dans l'ordre croissant)
Figure 12
PM : marqueur de poids moléculaire ; B :
plasmide B digéré ; A : plasmide A digéré

4. Dans cette électrophorèse, les fragments d' ADN :

A. ont été séparés en fonction de leur charge
B. ont été séparés grâce à leur charge
C. ont été séparés en fonction de leur taille
D. ont été séparés en fonction de leur nombre de paires de bases
E. ont été dénaturés sous forme de simples brins
5. En sachant que dans les 2 plasmides l'enzyme de restriction utilisee ne peut
générer 2 fragments de même taille, combien de sites de restriction cet insert
contient-i1 ?
6. Quelle est la longueur approximative de l'insert (estimer la longueur grâce à la
droite Ln (taille en pb) = f (distance de migration» ?
7. Un autre plasmide (C) dérive lui aussi du plasmide A par insertion d'un autre
fragment d’ADN. Son analyse à été faite de la même façon que pour le plasmide
B. Les résultats obtenus sont reportes dans la figure 13 et le tableau 3. Quelle est
la taille approximative de ce 2eme insert ?

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Figure 13 PM: marqueur de poids Tableau 3. Distance de migration(en

moléculaire ; C: plasmide C digéré ; mm) des différents fragments
A : plasmide A digéré (classement dans l'ordre croissant)

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