TD N°4 Génie génétique : Le Clonage

Exercice 1 : Clonage et analyse de l'ADN recombinant

On souhaite étudier le gène de la souris homologue au gène M du b¦uf qui a été cloné dans un
autre laboratoire. Pour cela, on essaie de cloner au site Eco RI du vecteur plasmidique
pBR330 (voir schéma) un fragment Eco RI-Eco RI d'ADN génomique de souris portant le
gène homologue au gène M du b¦uf.

a- Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez les clones

recombinants.

b- Un des plasmides recombinants contenant le gène M (appelé pBM1) est digéré par les
enzymes de restriction Bam HI et Eco RI. Après migration et séparation des fragments d'ADN
sur gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium, on obtient les profils de restriction
suivants:

b- Donnez la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.

c- Un transfert sur membrane de nitrocellulose (Southern blot) est préparé à partir du morceau
du gel de la question b correspondant à la double digestion Eco RI-Bam HI. La membrane est
hybridée avec une sonde constituée du plasmide pBR330 marqué au 32P. Parmi les 5
fragments générés lors de la double digestion Eco RI-Bam HI, à quel(s) fragment(s)
s'hybridera la sonde?
Exercice 2 : Clonage et hybridation moléculaire de type Southern
On clone un fragment d'ADN génomique Eco RI-Bam HI de 2 kb d'Arabidopsis thaliana aux
sites Eco RI et Bam HI du plasmide pBLQ54 (voir schémas ci-dessous).

Région de l'ADN génomique d'A. thaliana contenant le fragment Eco RI-Bam HI de 2 kb:

a- On appellera pARABIDO le plasmide recombinant obtenu à l'issue du clonage. Présentez

un schéma du plasmide pARABIDO et positionnez les sites de restriction sur ce schéma.

b- Pour contrôler le résultat du clonage, on fait une analyse par restriction de pARABIDO en
utilisant les enzymes de restriction Hind III et Pvu II séparément puis en réalisant une
électrophorèse en gel d'agarose. Schématisez ce que l'on doit observer à l'issue de
l'électrophorèse pour les deux digestions enzymatiques en indiquant en clair les tailles des
différentes bandes obtenues.

c- Enfin pour s'assurer du résultat, on réalise un transfert sur membrane de nitrocellulose

(Southern blot) à partir du gel de la question b. La membrane est hybridée avec une sonde
constituée du fragment Eco RI-Bam HI d'ADN génomique d'A. thaliana marqué au 32P.
Parmi les fragments générés lors des digestions de pARABIDO par les deux enzymes de
restriction
(Hind III et Pvu II), à quel(s) fragment(s) s'hybridera la sonde?
 Corrigé type TD N°4 : clonage

Exercice 1 :
a- Préparation de l'insert: Extraction d'ADN génomique de souris. Digestion partielle de cet
ADN par l'enzyme de restriction Eco RI, de manière à générer des fragments de 5 à 10 kb.
Electrophorèse préparative pour purifier sur gel les fragments de 5 à 10 kb.

Préparation du vecteur: Digestion complète de pBR330 par Eco RI. Déphosphorylation des
extrémités.

Clonage: ligature des inserts et des vecteurs. Transformation de cellules d'E. coli.
Recommencer les étapes précédentes jusqu'à avoir 10 e+6 colonies transformées
indépendantes.
Sélection: sélection des colonies transformées sur milieu contenant de la streptomycine. Pour
estimer le taux de colonies qui ont reçu un plasmide contenant de l'ADN génomique de souris,
repiquage d'environ 500 colonies sur milieu contenant de l'ampicilline: seules les colonies qui
ont reçu un plasmide ne contenant pas d'ADN génomique de souris poussent.
Sélection des clones contenant l'homologue du gène M du b¦uf: transfert des 10 e+6
colonies sur filtre et hybridation moléculaire de type Southern avec la sonde constituée du
gène M de b¦uf (technique dite de "l'hybridation sur colonies").

b-

c- Les fragments de 2,5 et de 3,5 kb.

Exercice 2

a-

b-

c- A un des deux fragments Hind III de 3,5 kb ainsi qu'aux fragments Pvu II de 2 et
2,5 kb.