CHAPITRE I:

LES PRINCIPAUX OUTILS DE

GENIE GENETIQUE
I- LES ENZYMES
1-1 Les enzymes qui coupent l’ADN
les enzymes de restriction
la Dnase
la nucléase SI
1-2 Les enzymes qui ligaturent
la ligase
1-3 Les enzymes qui déphosphorylent
les phosphatases alcalines
1-4 Les enzymes qui phosphorylent
les kinases
1-5 Les enzymes qui recopient un acide nucléique
a- ADN ADN
ADN pol I
Klenow
Sequenase
La Taq pol
b- ARN ADN
La retrotranscriptase RT
c- ADN ARN
L’ARN pol
1-1 Les enzymes qui coupent l’ADN
a- Enzyme de restriction (enzymes de type II)
 Isoler de micro-organismes, le plus souvent des
bactéries (>100 actuellement utilisable).
 Endonucléase, reconnaissent des séquences de
4 à 10 nucléotides.
 Couper l’ADN db en des séquences spécifiques =
palindrome
 Coupures : -franche(coupent le site en son milieu
- cohésive(dissymétrique, collantes)
 Conditions opératoires (T°, force ionique)
séquences
nucléotidiques de l ’ADN
reconnues par des
nucléases de restriction
couramment employées.
nomenclature
Séquences de reconnaissances
de quelques endonucléases
Notion d’isoschizomères
Enzymes de restriction différentes peuvent
reconnaître des mêmes sites spécifiques
Ils fournissent souvent après clivage enzymatique
des fragments dont les extrémités sont différentes.
Exemple :Soit la séquence suivante: GGTACC, cette
séquence est coupée par l’enzyme Kpn I et
l’enzyme Acc65 I:
Kpn I: 5’-G-G-T-A-C/C-3’
3’-C/ C-A-T-G-G-5’
Acc65 I: 5’-G/G-T-A-C-C-3’
3’-C-C-A-T-G/G-5’
Notion d’enzymes compatibles
Deux enzymes de restriction sont dites
compatibles quand elles génèrent après
digestion des fractions aux extrémités cohésives
complémentaires.
Ces fragments peuvent être facilement ligaturés.
Exemple: Les enzymes Bam HI (G / GATCC) et
Mbo I ( / GATC)
b- La Dnase
 endonucléase
 Coupe l’ADN db et sb au hasard
 Origine bovine (pancréas)
 Mn++ les 2 brins au m endroit
Mg++ chaque brin indépendamment

c – La nucléase S1
 Attaque l’ADN sb
 Isoler d’Aspergillus oryzae
1-2 Les enzymes qui ligaturent
la ligase
 Liaison P di ester entre 5’ P et 3’ OH
 Nécessite ATP
 + facile de ligaturer 2 fragments a bouts
cohésifs
 extraites de bactéries
1-3 Les enzymes qui déphosphorylent
les phosphatases alcalines
 pH alcalin
 Origine bactérienne (BAP) ou bovine (CIP)
 Elimination d’un gpt P en 5’ d’une chaine d’ADN

1-4 Les enzymes qui phosphorylent

les kinases
 Transfert d’un gpt P a partir d’une molécule d’ATP
à l’extrémité 5’ de l’ADN déphosphorylé
 extraites de bactéries
1-5 Les enzymes qui recopient un acide nucléique
Complémentaire, antiparallèle, 5 ’ → 3’.
Elles nécessitent la présence de NTPs ou dNTPs.

a- ADN ADN : ADN pol ADN dépendante

nécessite une amorce d’AN
ADN pol I , Klenow, Séquenase, La Taq pol
b- ARN ADN : ADN pol ARN dépendante
La retrotranscriptase RT ( isoler de rétrovirus)
ADN ARN: L’ARN pol ADN dépendante
capable d’initier une chaine
II LES VECTEURS
II- 1 Les bactériophages (phage λ, phage M13)
II- 2 Les plasmides (pBR322 pUC 18, 19)
II-3 Les phagémides
II- 4 Les cosmides
II-5 Les vecteurs navettes
II-6 Les banques YAC
II-7 Le plasmide Ti d’Agrobacterium temefaciens
II-8 Baculovirus
II-9 Vecteurs viraux des mammifères (rétrovirus,
adénovirus, SV40,…)
II- 10 Transfert direct des gènes (microinjection,
electroporation,… )
II/ Les Vecteurs
 Sont des petits ADN dans lesquels, on insère
le fragment d’ADN à étudier
 Ils possèdent dans leur génomes les signaux
nécessaires pour leur réplication mais ils
doivent être introduits dans des cellules hôtes
(Ex Bactérie)
II- 1 Les bactériophages
a- phage λ
Définition:
 Structure binaire
(tête + queue)
 ADNdb linéaire
48.5kb
avec 2 extrémités sb cohésives
Cycle biologique: 2 modes sont possibles
Lytique
Adsorption et pénétration:
Fixation sur des récepteurs codés par le gène bactérien
(transporteur de maltose)
Pour augmenter le nombre de récepteurs  ?
ADN phagique est injecté dans la cellule hôte et va se
circulariser par complémentarité des extrémités cos 
site cos (ligase bactérienne)
Multiplication du phage:
Réplication de l’ADN et synthèse des protéines de tête
et queue, ensuite Le site cos est clivé par protéinées
phagiques
Assemblage et libération des phages:
par lyse bactérienne (200 phages matures/ bactérie)
Lysogénique
Intégration dans le génome bactérien et
transmission à la descendance.
Adsorption et pénétration:
même chose que précédemment
 multiplication virale:
Les gènes qui codent le cycle lytique (Ex tête,
queue…) sont réprimés par un répresseur codé par
le gène cI.
Le mode de multiplication dépend donc du gène cI
(actif ou inactif)
modifications apportées au phage λ
Réduction du nombre de sites de restriction
identiques:
(Ex 5 sites EcoRI 1 ou 2 sites)
Délétion des parties non essentielles:
élimination de la région impliquée dans la
lysogénie et la recombinaison
Insertion d’un fragments de l’opéron lactose:
LacZ (+ son promoteur en amont)  sélection
visuelle des phages recombinants.
Plages de lyse blanches s’ils ont inséré un
fragment étranger et bleues s’ils n’ont pas
intégré.
Description de qlq phages λ
Vecteurs d’insertion : 1exemplaire du R .S. (<7kb)
λ gt10: site EcoRI unique est situé dans le gène
cI  sélection ?
 λgt11: site EcoRI unique est situé dans le Lac Z
 sélection ?
NB: utilisation de souches spéciales dites «Lac ?»
Vecteurs de substitution ou de remplacement :
2 exemplaires des sites de restriction identiques
espacés de qlq Kb, encadrant la partie non
essentielle qui peut être remplacée par l’ADN
étranger.  (23kb) Ex EMBL3 et 4
L’empaquetage in vitro
Insertion de l’ADN étranger se fait sur l’ADN
phagique nu (modifié) qui n’est pas infectieux, il
doit être revêtu par ces protéines phagique afin
de reconstituer un phage fonctionnel capable
d’infecter la bactérie où il va se multiplier
L’ADN recombinant est incubé en présence des
protéines de la tête et la queue  empaquetage
in vitro (packaging)
b- phage M13
Définition
• Filamenteux
• Spécifique pour E. coli (plasmide F)
• ADN sb circulaire (brin +) 6.4kb
• 10 gènes + 2 régions non codantes
Cycle biologique
Entrée de M13 via le pilus F d’E. coli
Multiplication de M13 les « RF »
Après être débarrassé de sa capside, le brin (+) est
complété RF (db); après ++ cycles de réplication
(100 à 200 RF)  la synthèse devient
asymétrique  seul le brin (+) sera synthétisé
Il sera revêtu de protéines lors de l’expulsion à
travers la membrane
A la différence de  ???
Modifications apportées au phage M13
Introduction d’un polylinker et suppression des
sites pré-existants
Un polylinker est un petit fragment db synthétisé
chimiquement introduit ds un vecteur (phage ou
plasmide) → un choix de sites de restriction
uniques
Les séries du messing M13 mp
Famille de M13 portants des polylikers +/- long
Ils sont livrés sous forme db, pourquoi?
Ils sont Proposés par couple
(M13mp1/M13mp2,… mp18/mp19)
chaque couple offre les m RS, mais disposés dans
2 ordres inverses avantage: retournement de
clone
 le plus utilisé M13mp18/mp19 offre 13 RS 
Où est situé ce polylinker?
Polylinker dans le Lac Z  le tout dans une des
régions non codantes « inter géniques »
Intérêt?
clonage ds les vecteurs M13
II- 2 Les plasmides
 Petit ADN db circulaire
 Origine bactérienne
 Réplication autonome (indépendants du
génome bactérien).
 Le nombre varie de 1 à 20 copies / B* (contrôle
par le gène Rop)
 Au labo : plasmides artificiels à partir de
plasmides naturels
pBR322
2 gènes de résistance ( Amp, Tc)
Insertion dans l’un des 2 sites → sélection?
pUC 18, pUC19
pUC18
• 2.7 kb
• Comparable a M13mp18 (operon lac,
même polylinker)
NB : pUC18/ pUC19 (polylinker de façon
inverse)
• Un gène de résistance à l’amp
La sélection ?

?
II-3 Les phagémides
Vecteur artificiel hybride (phage M13 + plasmide)

Avantage?

Ex pBlue script II
II-4 Les cosmides
Vecteur artificiel hybride (Phage λ + plasmide)
Ils possèdent polylinker, AmpR (proprieté des
plasmides)
Originalité: présence des extrémités cos

Empaquetage
Avantage ?
Clonage dans les cosmides
II-5 Les vecteurs navette
 Acceptés par ++ espèces
 Signaux nécessaires pour la réplication ds E.coli
et l’expression dans une Cellule eucaryote

Intérêt?
II-6 Les banques YAC (yeast artificial chromosome)
 Cellule hôte eucaryote: la levure
saccharomyces cereviciae
 Se réplique de la m façon que le chr de la C hôte =
même caractéristiques (ori?, centromère?,
télomères?)
 Insertion de très gd fragments (++ centaines de
Kb)
1 clone = l’intégralité d’un gène de mammifère)
 Cartographier de génome humain
 Similaire aux YAC : les BAC, les PAC
II – 7 Le plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens
 La ¢ Vg* n’a pas de plasmide naturel (vecteur)
 A. tumefaciens infecte les plantes
 une partie du plasmide Ti (T-ADN) s’intègre
Au niveau du chr de la ¢ Vg* → non contrôlée
→dvpt d’une blessure en couronne (tumeur)
 Le plasmide Ti recombinant → ?
(Le gène d’intérêt)
 Le plasmide Ti (200Kb) → difficulté de
manipulation → utilisation de plasmides
bactériens d’E coli
→transformation d’A. tumefaciens
II -8 Baculovirus
 Infecte les ¢ des insectes
 Une des protéine majeure la polyédrine
s’accumule ds le N des ¢ infectées en gde quantité?
 promoteur extrêmement actif
 mm promoteur → expression du gène d’Intérêt
 Intérêt : ?
II-9 Les vecteurs viraux des mammifères
Vecteurs basés sur des virus
 SV40:
 Infecte un gd nbre d’espèces mammifères
 V* A* à ADN db
 Petite taille → utilité limitée (gros fragments)
 Contrainte d’empaquetage
 Rétrovirus
 V* à ARN m b → infection → ADN db (RT)
→intégration stable
 Vecteur très utilisé en thérapie génique (ADN
étranger incorporé de façon stable)
 contrainte: nécessite des cellules en division
II- 10 Transfert direct des gènes

transitoire permanente
Ex: 1 gène eucaryote Ex: 1 gène introduit
sur 1 plasmide bactérien par micro injection
ou transfection
↓
peut s’intégrer et s’exprimer a travers ++ cycles
↓
sélection des ¢ transfectées
Ex/ de transfert direct: liposome, microinjection,
electroporation
III- LA CELLULE HOTE
 Les 1iers isolements et analyse → E. coli
(généralement)
 La réplication des vecteurs indépendamment des
chr des ¢ hôtes (certains s’intègrent)
 La ¢ hôte:
 Ne doit pas être pathogène
 Ne synthétisant pas d’enzyme de restriction
 Souche spécifique au vecteur :
Ex: E. coli lac- →?, E. coli male → ?
S. cereviciea → ?, insecte → ? ………..
IV- LES SONDES NUCLEOTIDIQUES
IV- 1 définition
Segment d’AN utilisé pr repérer le fragment
recherché par hybridation moléculaire
IV-2 Caractéristiques
1 segment d’AN obligatoirement sb
Complémentaire et antiparallèle au fragment
recherché qui doit être aussi sb
Hybride entre ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN
+/- longue selon les cas: elle peut couvrir une
partie ou la totalité du fragment rechercher
 la sonde doit être repérable:
chaude (radioactive) dangereuse → tendance à
utiliser des sondes froides (fluorescence,
luminescence, coloration,….)
Ex: digoxigenine (DIG) un stéroïde détecté par Ac
lié à une enz qui catalyse la formation d’un produit
coloré