Biochimie Microbienne

Biochimie microbienne L3 MICROBIOLOGIE
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INTRODUCTION
Le métabolisme bactérien est l’ensemble des réactions biochimiques et
physiologiques se déroulant au sein de la bactérie. Il est divisé en deux voies :
• celle impliquée dans la dégradation de substrats avec production d’énergie
• celle impliquée dans la synthèse de nouvelles molécules nécessaires à la

construction de structure bactérienne avec consommation d’énergie
provenant des réactions de dégradation.
L’ensemble de ces réactions est sous le contrôle de catalyseurs biologiques

appelés enzymes.
De l’étude du métabolisme découlent plusieurs applications :

• l’isolement qui peut être défini comme l’ensemencement effectué dans un
but de séparation, de façon à obtenir à partir des colonies nettement
séparées. L’isolement permet d’obtenir des cultures pures indispensables
à toute étude et à toute identification.
• la mise en évidence des besoins nutritifs des bactéries et des voies du

métabolisme qui permettent l’identification conventionnelle des bactéries
(la dégradation du substrat, la synthèse d’un produit final ou

l’intermédiaire du métabolisme)
I METABOLISME BACTERIEN
METABOLISME BACTERIEN DANS L’ISOLEMENT ET L’IDENTIFICATION 1

Les bactéries ont en général pour source d’énergie des composés organiques
suffisamment réduits pour donner des électrons, qui sont transportés jusqu’à
différents accepteurs :
- oxygène : les électrons sont transportés sur la chaîne des

cytochromes jusqu’à l’oxygène moléculaire (respiration aérobie) ;
- un substrat inorganique oxygéné comme les nitrates (respiration

nitrate), les sulfates (respiration sulfate) , les carbonates (
cytochrome dépendante) ; - un substrat organique oxygéné ou la
chaîne des cytochromes n’intervient pas (fermentation).
La plupart des voies métaboliques produisant de l’énergie par oxydation d’un

substrat organique aboutit au pyruvate ou à l’un de ses précurseurs ou dérivés. Il
s’agit donc d’une plaque tournante du métabolisme bactérien. Le glucose peut
être considéré comme le substrat énergétique type. L’oxydation du glucose peut
être réalisée par trois voies différentes qui peuvent fonctionner en parallèle : ce
sont les voies de la glycolyse, le shunt des pentoses phosphates et la voie
d’Entner Doudoroff qui est spécifique au monde microbien.
I-1 Voie d’Embden –Meyerhoff

Il s’agit de la principale voie de dégradation des glucides. La glycolyse est
l’ensemble des réactions qui oxydent le glucose en pyruvate. Cette chaîne de
réactions a lieu dans le cytosol au niveau des formations membranaires et peut
être réalisée en milieu aérobie et anaérobie.
La glycolyse se divise en deux phases :

- la phase préparatoire où le glucose est transformé en glycéaldehyde
3 P avec consommation d’énergie (phase d’activation)
- la phase de remboursement qui est une oxydoréduction couplée à la

formation d’ATP et de pyruvate.
NB La formule du glucose
6 CH2OH
5 O
4 OH .1
OH. 3 2 OH
OH
I-1-1 Les différentes étapes de la glycolyse (voir figure I)
• Phosphorylation du glucose en glucose 6 P
Cette réaction est catalysée par l’hexokinase ou le glucokinase. Elle est

irréversible et exergonique.
L’hexokinase est présente dans de nombreux tissus et n’est pas spécifique au

glucose en ce sens qu’elle peut être utilisée pour phosphoryler d’autres oses
(mannose, fructose…).
• Isomérisation du glucose 6 P en fructose 6 P par la

phosphoglucose isomérase
Le Glucose 6 P est un carrefour métabolique, le carbone 2 est le seul à avoir un

OH en position axiale ce qui facilite son oxydation. La réaction se fait sans
changement important d’énergie interne. Elle est donc réversible.

• Phosphorylation du fructose 6 P
La phosphofructokinase catalyse la phosphorylation du fructose 6 P sur son

carbone 1. L’ATP en présence de magnésium est le coenzyme donneur
d’énergie et de phosphate. La réaction est exergonique et irréversible. On obtient
le fructose -1,6-diphosphate
La PFK est l’enzyme la plus lente de la glycolyse. Elle catalyse l’étape

d’engagement des glucides dans le métabolisme énergétique.
Elle est donc l’enzyme clé qui limite la vitesse de l’ensemble.
• Scission du fructose di P en trioses phosphate
L’aldolase, présente dans toutes les cellules, catalyse la scission du fructose 1,6
di P en trioses P.
Les carbones 4, 5 et 6 du fructose 1,6 di P ont donné le phosphoglycéraldéhyde.

Les carbones 1, 2 et 3 donnent la P di OH acétone.
• Isomérisation des trioses phosphates
Les deux trioses phosphates sont des isomères. La transformation du cétose en

aldose est faite par le triose phosphate isomérase qui, comme le phosphohexose
isomérase, catalyse une oxydoréduction interne entre les carbones 1 et 2. Dans
la suite de la glycolyse, seul le phosphoglycéraldéhyde va être utilisé : il y a
conversion de la phospho di OH acétone en 3 P glycéraldéhyde.

• Oxydation phosphorylante du 3 P glycéraldéhyde en 3 P
glycérate
La phosphoglycéraldéhyde déshydrogénase catalyse l’oxydation du 3 P

glycéraldéhyde. Son coenzyme libre est le NAD oxydé et son substrat est le 3 P
glycéraldéhyde.
En effet, l’enzyme s’attache au substrat par une liaison aldéhyde thiol qui se
trouve déshydrogénée en liaison acyl thiol riche en énergie. L’acide
phosphorique libre intervient alors pour phosphoryler cette liaison et former
l’acide diphosphorique 1, 3 glycérique. Cet acide possède un radical
phosphorique lié par une liaison riche en énergie : il peut être transféré par une
molécule d’ADP pour former une molécule d’ATP grâce à la 3 P glycérate
kinase et ce qui aboutit à l’acide 3 P glycérique.
• Isomérisation du 3 P glycérate
La phosphoglycérate mutase transforme le 3 P glycérate en 2 P glycérate. Elle a

pour coenzyme le magnésium.
Le mécanisme est de type ping-pong : l’enzyme phosphorylée au départ

transfère son phosphate sur le 3 P glycérate qui devient 1, 3 DPG et reste lié à
l’enzyme.
Dans un 2ème temps l’enzyme déphosphorylée réagit avec le 1- 3 di P G pour

récupérer son phosphate et libérer le 2 P glycérate. La réaction est presque iso
énergétique et donc réversible.

• Déshydratation du 2 P glycérate en prosphoénol pyruvate
Cette réaction est catalysée par l’énolase qui utilise comme coenzyme le
magnésium. Elle est inhibée par les ions fluorures. La réaction est réversible.
• Formation du pyruvate
Le Phospho-énol pyruvate est riche en énergie. Le pyruvate kinase catalyse le
transfert direct du radical phosphoryle et de l’énergie sur l’ADP. La grande
quantité de chaleur libérée rend cette réaction irréversible.

GLUCOSE
ATP Glucokinase ou hexokinase
ADP magnésium
GLUCOSE -6- PHOSPHATE
Phospho-glucose isomérase
magnésium
FRUCTOSE -6- PHOSPHATE

ATP Phospho-fructokinase
ADP magnésium
FRUCTOSE 1,6 -DIPHOSPHATE

Aldolase
PHOSPHO-DIHYDROXY-ACETONE + 3 PHOSPHO-GLYCERALDEHYDE
Triose- phosphate isomérase
3 PHOSPHO-GLYCERALDEHYDE
NAD+ PO4H3
NADHH+ Phospho-glycéraldéhyde déshydrogénase
ACIDE 1,3 DIPHOSPHO-GLYCERIQUE

ADP Phosphpglycérate kinase
ATP magnésium
ACIDE 3 PHOSPHO-GLYCERIQUE
Phosphpglycérate mutase
magnésium
ACIDE 2 PHOSPHO-GLYCERIQUE
H2O Enolase
magnésium
ACIDE PHOSPHO-ENOL PYRUVIQUE

ADP Pyruvate kinase
ATP Magnésium, potassium
ACIDE PYRUVIQUE
Figure I : LES ETAPES DE LA GLYCOLYSE
I-1-2 Métabolisation de l’acide pyruvique
I-1-2-1Fermentation alcoolique
Chez certains microorganismes, de l’éthanol est formé à partir du pyruvate.

Cette fermentation se fait en 2 temps.
- 1er temps : conversion du pyruvate en acétaldéhyde grâce à la

pyruvate décarboxylase
- 2ème temps : réduction de l’acétaldéhyde en éthanol grâce à un

alcool déshydrogénase.
Pyruvate décarboxylase Alcool déshydrogénase

CH3 – CO - COOH CH3 – CHO CH3 –CH2OH
CO2 NADHH+ NAD+
Figure II : La fermentation alcoolique de l’acide pyruvique

I-1-2-2 Formation du lactate
Le lactate est formé normalement à partir du pyruvate chez divers organismes.

Cette réaction se produit également chez les organismes supérieurs lorsque la
quantité d’O2 est limitée (exemple : travail musculaire intense).
Lactate déshydrogénase
CH3 – CO - COOH CH3 –CHOH - COOH

NADHH+ NAD+
Figure III : La formation du lactate à partir du pyruvate
I-1-2-3 Oxydation du pyruvate en acétyle coenzyme A
Dans certaines conditions aérobies le NADHH+ est réoxydé dans la chaîne

respiratoire mitochondriale. De plus lorsque suffisamment d’O 2 est disponible le
pyruvate peut être oxydé dans la mitochondrie grâce à une décarboxylation
oxydative catalysée par le complexe de la pyruvate déshydrogénase.
I-1- 2-4Transformation de l’acide pyruvate en acide oxalo

acétique
Cette réaction est catalysée par la pyruvate carboxylase

pyruvate carboxylase
CH3 – CO – COOH COOH – CH2 – CO – COOH

Figure IV: La transformation de l’acide pyruvique en acide oxaloacétique[28]
I-1-3 Bilan énergétique
• En anaérobiose
1.1 GG6P - 1 ATP
F6P F 1,6 di P - 1ATP
1,3 di P glycérate 3 P glycérate +2ATP
P énol Pyruvate pyruvate + 2ATP
Equation globale:
G + 2 NAD+ + 2 Pi + ADP 2 pyruvate + 2 NADHH+ + 2H2O + 2ATP
• En aérobiose
1 glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2NAD
+
2 Acide pyruvique + 2 NADHH + ATP
2 NAD+ 2 NADHH+
2 Acétyl COA chaînes respiratoires

cycle de Krebs (2 + 2) x 3 =12 ATP
2 x 12 ATP =24 ATP
Ce qui fait qu’en aérobiose le bilan = 36 ATP
Le bilan énergétique final est :
1 glucose CO2 + HO2 + 38 ATP
Figure V : Bilan énergétique de la glycolyse
I-1-4 La régulation de la glycolyse
Le cas le plus spectaculaire est vu chez les micro-organismes qui sont aérobies
et anaérobies facultatifs , les levures qui sont transférées d’un milieu sans O 2 à
un milieu oxygéné ont une réduction de 75% de leur glycolyse tout en gardant
constante leur production d’ATP.
La régulation a lieu à deux niveaux :
- Au niveau fondamental : les dernières réactions sont

isergoniques, réversibles et dépendantes des concentrations en substrats
et produits. Un excès de glucose entraîne une augmentation de la
glycolyse et un excès de pyruvate entraîne une diminution de cette
glycolyse.
- Au niveau enzymatique, la régulation est réalisée en trois

étapes :
• Réaction 1 : avec la glycokinase l’excès de produits diminue

la réaction.
• Réaction 3 : la phosphofructokinase est inhibée par l’ATP et

est activée par les substrats (ADP, AMP et Pi).
• Réaction 9 : le pyruvate kinase est aussi inhibé par l’ATP et

est activée par l’ADP, l’AMP et le Pi.

I-1-5 Rôle des enzymes
Les enzymes jouent le rôle de catalyseurs et vont orienter la réaction d’une

manière bien spécifique.
Les enzymes sont caractérisées par leur rapidité leur spécificité et leur
température.
I-1-6 Rôle des cofacteurs
Les cofacteurs sont des ions inorganiques ou des coenzymes.

Il existe des cofacteurs nicotiniques comme le NAD et le NADP.
Les enzymes à NAD+ sont les accepteurs d’Hydrogène, ils sont stockés dans la
cellule sous forme oxydée par contre les enzymes à NADP + sont des donneurs
d’Hydrogène on les retrouve dans la cellule sous la forme réduite
On a les coenzymes flaviniques comme le FAD dont le rôle est de transporter
l’hydrogène qui provient du NAD sous la forme réduite ou au cours de la
réaction redox.
L’ion magnésium est un activateur qui participe à la stabilité de la structure

tertiaire Exemple : Mg / ATP
L’ATP et l’ADP interviennent dans les phénomènes de phosphorylation et de

déphosphorylation.

I-2 La voie des pentoses phosphates
C’est la voie de shunt des pentoses, voie des hexoses monophosphates ou

phosphogluconate. La voie a pour siège le foie, les tissus adipeux, la glande
mammaire en lactation et le cortex. Elle va jouer deux rôles essentiels :
- La production du NADPH, H pour la réduction du glutathion
- La production du ribose qui entre dans la constitution des acides nucléiques de

l’ATP de l’ADP et du FAD.
G 6 P + NADP + H2O ribose 5 P + 2 NADPH, H + CO 2
I-2-1 Les différentes étapes

La voie des pentoses phosphates se divise en 2 phases :
une phase oxydative irréversible
une non oxydative réversible
- La phase oxydative
Le glucose 6 phosphate subit une oxydoréduction catalysée par le glucose

6phosphate déshydrogénase pour donner une phosphogluconolactone. Cette
phosphogluconolactone va subir une hydrolyse par une gluconolactonase pour
donner l’acide 6 phosphogluconique.

Cette dernière subit une autre réaction d’oxydoréduction catalysée par une
phospho-gluconate déshydrogénase, suivie d’une décarboxylation spontanée
pour donner le ribulose 5 phosphate.
- La phase non oxydative
Isomérisation
Cette phase débute par une inter-conversion des pentoses phosphates (ribulose 5
phosphate).
Isomérase épimerase
Ribose 5 P Ribulose 5 (P) xylolose 5P
Transcétolisation
Xylulose 5 P + Ribose 5 P sous l’action de la transcétolase qui transfère un
radical dicarboné (CH2OH – CO) d’un donneur vers un accepteur, donnent le
glycéraldéhyde 3Pet le sédoheptulose 7 P.
Transaldolisation
Glycéraldéhyde 3 P + Sédoheptulose 7 P, sous l’action d’une aldolase qui

transfère un radical tricarboné d’une fonction cétonique sur une fonction
aldéhyde, donne érythrose 4 P et fructose 6 P.
Transcétolisation

Une deuxième transcétolisation, analogue à la première, catalysée par le même
transcétolase utilise l’érythrose 4 P comme accepteur d’un radical dicarboné,
d’un troisième pentose (xylulose 5 P).
Cette réaction va donner du glycéraldéhyde 3 P et du fructose 6 P.
En résumé la voie des pentoses phosphate aboutit à former donc le même triose
P que la voie glycolytique d’Emden Meyerhof.
Mais ici chaque hexose ne donne qu’un seul triose, et ce triose peut ensuite
entrer dans la voie glycolytique (transformation en acide purivique, en acétyl
coA puis oxydation par le cycle de Krebs).
Mais il peut aussi régénérer le glucose par combinaison de triose P réversible

sous l’action de l’aldolase.
2 Triose P Fructose 1,6 di P Fructose 6 P G6 P
I-2-2 Bilan
G6P + 12 NADP 6CO2 + 12 NADPH,H+ + Pi I-2-3

Intérêt de la voie des pentoses
L’intérêt de cette voie réside, en ce qu’elle est génératrice d’une part : -

de NADPHH+ indispensable aux réactions réductrices de
biosynthèse (en particulier lors de la synthèse des acides gras et des
stéroïdes)
- d’autre part de ribose 5 P : qui est le précurseur de la synthèse des

nucléotides et des acides nucléiques.

I-2-4 Régulation
La régulation sera assurée par le NADP. Cette NADP est un accepteur

d’hydrogène.
La phase non oxydative va être contrôlée par la disponibilité en substrat.
I-3 La voie d’Entner-Douroroff
Bien que la glycolyse soit la voie la plus commune pour la conversion des
hexoses en pyruvate, la voie d’Entner-Douroroff joue un rôle similaire.
Certaines bactéries utilisent cette voie pour décomposer le glucose en pyruvate
et en glycéraldéhyde P. Ces derniers pourront ensuite être transformés en
éthanol par fermentation alcoolique.
I-3-1 Les différentes étapes de cette voie
- Phosphorylation du glucose
Le glucose, en présence de l’ATP, s’acquiert d’un phosphate pour donner du

glucose P par la glucokinase.
- Formation du 6-Phosphogluconate
Le G6P sous l’action du G-6Pdéshydrogénase et en présence de NADP donne

du 6-phosphogluconate.

- Formation du 2 céto-3 désoxy phosphogluconate
Le 6- Phosphogluconate perd une molécule d’eau et conduit à la formation du

2céto-3 désoxy phosphogluconate (CDPG).
- Clivage du CDPG
Sous l’action de l’aldolase , le clivage du CDPG donne du pyruvate et du

glycéraldéhyde 3 P ; glycéraldéhyde qui sera converti en pyruvate. Mais
le pyruvate, chez les microorganismes a la particularité de subir une
fermentation pour conduire à la formation de l’éthanol.
La voie d’Entner Doudoroff dégrade donc le glucose en pyruvate et produit un

ATP, un NADPH et un NADH par glucose métabolisé.
On peut avoir également le bilan suivant si le pyruvate est fermenté en éthanol.
Glucose + ADP + Pi CO2 + 2 éthanol + ATP
I-4 Cycle de Krebs
Ce cycle constitue la voie commune terminale à l’oxydation des molécules

énergétiques. Les unités dicarbonées issues de la dégradation de certains
composés organiques tels que les acides gras et les glucides vont être dégradés
au cours du cycle de Krebs.

Cette oxydation va se faire au niveau de la matrice mitochondriale. Les enzymes
intervenant sont des enzymes solubles dans l’espace matricien. Une seule
exception est la succinite désydrogénase.
I-4-1 Les différentes étapes
1ère étape : condensation irréversible de l’acétyle COA avec AOA
ACETAL- CoEnymeA citrate synthase CoA-SH

+ acide citrique acide Oxalo-
Acétique 2 HO
2ème étape : Isomérisation réversible de l’acide citrique en acide isocitrique
H2O
acide citrique acide Cis Aconitique
aconitase
H2O
Acide iso-Citrique
3ème étape : formation de l’acide α-cétoglutarique (l’isocitrate déshydrogénase est l’enzyme)
+ +
NAD NADHH
Isocitrate Acide oxalo succinique
CO2
Acide α-cetoglutarique
4ème étape : Décarboxylation oxydative de l’acide α-cétoglutarique en succinyl COA , l’enzyme est l’alpha
cétoglutarate déshydrogénase.
NAD+ NADHH+

Ac-α-cetoglutarique Succinyl COA
HSCOA CO 2
5ème étape : Formation de l’acide succinique ( l’enzyme est le succinyl thiokinase)
COASH
Succinyl COA Acide succinique
GDP +Pi GTP
ATP ADP
GDP
6ème étape : Déshydrogénation de l’acide succinique en acide fumarique
Succinate
acide succinique déshydrogénase Acide fumarique
FAD FADH2
7ème étape : Hydratation de l’acide fumarique en acide malique (l’enzyme est la fumarase)
Fumarate fumarase Malate
H2O
8ème étape : Déshydrogénation du Malate en AOA

malate déshydrogénase
Malate AOA
NAD + NADHH+
Figure VI : Le cycle de Krebs
I-4-2 Bilan et intérêt

3 NADHH 3 x 3 ATP
1 FADHH 2 ATP
1 GTP 1 ATP
12 ATP
Le cycle de Krebs permet d’obtenir 12 molécules d’ATP
Acétyl CoA + 2H2O + 3 NAD + FAD + ADP + Pi CoASH + 3NADH,H+ + 2 FADH2 + 2 CO2 + ATP
3 NAD 3 x 3 ATP
FAD 2 ATP
GTP 1 ATP
12 ATP
I-4-4 Régulation
Elle est envisageable à plusieurs niveaux :

La 1ère étape catalysée par la citrate synthase à ce niveau on aura une inhibition
allostérique par l’ATP on va modifier le Km de l’enzyme par une diminution de
l’affinité donc augmentation du Km de la citrate synthase.
La 2ème étape catalysée par l’isocitrate déshydrogénase : on a ici une inhibition

par le NADH, H+.
La 3ème étape du complexe alpha-cétoglutarate déshydrogénase : on va avoir une

inhibition par le succinyl CoA aussi par le NADH,H+.

I-5 Catabolisme des disaccharides
Le catabolisme des disaccharides se fait à l’aide d’enzymes très spécifiques de la

liaison glucidique. La recherche de ces enzymes est utilisée pour l’identification
bactérienne. Les enzymes peuvent également hydrolyser les analogues des
disaccharides pour donner des produits colorés.
Exemple : ONPG lactose

Orthonito-phenyl -D galactopyranoside
Parmi les principales enzymes recherchées nous avons :

- la B-galactosidase pour le lactose
- la maltase pour le maltose
- l’invertase pour le saccharose.
Ces enzymes libèrent respectivement le glucose, le galactose et le fructose. Le
glucose sera dégradé par la glycolyse, le fructose est phosphoryle et rejoint la
glycolyse et le galactose est épimérisé en glucose et rejoint la glycolyse
I-6 Dégradation des polysaccharides
Les polysaccharides les plus utilisés sont l’amidon et la cellulose. L’amidon est
dégradé par les amylases (exoenzymes). La cellulose est dégradée par des
bactéries cellulosiques.
I-7 Anabolisme des glucides

Lorsque le développement de la bactérie est limité par une cause autre que la
source d’énergie et de carbone, la bactérie accumule le glucose sous forme d’un
polymère : le glycogène.
Glucose + ATP Glucose 6 P + ADP

Glucose 6 P + ATP (Glucose)n ADP + PP
I-8 Réduction de l’accepteur-Respiration-Fermentation
Les processus de réduction de l’accepteur final d’électrons sont fonction de

l’environnement bactérien (aérobiose ou anaérobiose), de la nature du substrat,
mais aussi de l’équipement enzymatique de chaque bactérie. Au-delà de la
formation du pyruvate plusieurs voies sont possibles.
I-8-1 Respiration aérobiose
Elle est caractérisée par la présence d’une chaîne de transport des électrons
située sur la membrane plasmatique et par la nature de l’accepteur final
d’électrons : l’oxygène de l’air.
Le pyruvate est transformé en acétyl-CoA qui entre dans le cycle de Krebs.
I-8-2Respiration anaérobiose
Chez certaines bactéries, la respiration peut exister en anaérobiose, l’accepteur

final d’électron est, soit le nitrate, soit le fumarate. Le processus est sous la
dépendance d’enzymes et de transporteurs d’électrons liés à la membrane
plasmatique.
• Respiration nitrate
Certaines bactéries sont capables de transformer le NO3 en NO2 grace à la

nitrate réductase d’autres peuvent poursuivre la réduction jusqu’au stade de N2
NO3- + 2H+ + 2è NO2- + H2O
NO3- + 2H+ + 2è NO2-H + N2
• Respiration fumarate
L’accepteur d’électrons est le fumarate qui est réduit grâce à une fumarate
réductase et un transporteur d’électrons (ménaquinone). La réduction d’une
mole de fumarate entraîne la production d’une mole d’ATP.
I-8-3 La fermentation
Dans ce processus, l’accepteur final est un composé organique. L’équipement

enzymatique des bactéries réduit le pyruvate, ou un dérivé, jusqu’à des produits
finaux caractéristique de certains groupes de bactéries. La fermentation a
toujours lieu en l’absence d’oxygène donc seules les bactéries anaérobies
strictes ou facultatives peuvent utiliser cette voie. On a la fermentation lactique,
la fermentation alcoolique, la fermentation des acides aminés et la fermentation
acides complexes.
I-9 Application à l’identification bactérienne
I-9-1 Les tests enzymatiques
o La catalase
Principe :La catalase est une enzyme qui décompose la peroxyde

d’hydrogène 3% en oxygène gazeux et en eau.
H2O2 catalase 1/2 O2+H2O
• o L’oxydase Principe : Le phényl diamine oxydase va agir sur un

substrat chromogénique incolore pour donner un composé rouge semi-
quinolone instable qui va s’oxyder pour donner un composé noirâtre.
I-9-2 Métabolisme glucidique
Bien que tous les glucides soient susceptibles d’être catabolisés, la première
étape consiste à déterminer la voie d’utilisation du glucose : voie oxydative chez
les aérobies strictes, voie fermentative chez les aéroanaérobies facultatives et
les anaérobies strictes, car les autres sucres seront utilisés selon la même voie.
• Epreuve de Hugh et Leifson

• Milieux d’études des glucides :
- eau peptonée au rouge de phénol
- milieu CTA (biomérieux)
- milieu de Kligler-Hajna
- mise en évidence des produits terminaux de la fermentation du glucose : test
de rouge de méthyle (RM) et le test de voges proskauer (VP). Le milieu
d’étude de ces deux tests est le milieu de Clark et Lubs.
I-9-3 Métabolisme protidique
Les protéines, avant d’être assimilées, sont dégradées en polypeptides qui sont
également dégradés en acides aminés.
La dégradation des protéines par des enzymes que sont les protéinases et les
peptidases précède leur assimilation.
L’étude du métabolisme protidique peut être envisagée sous plusieurs aspects :

- soit on peut faire l’étude de l’activité protéolytique (l’action des enzymes sur
les protéines)
- soit l’étude du métabolisme des acides aminés
- soit l’étude du devenir de certains dérivés de nature protéique comme l’urée
La possession des protéases
On étudiera leurs effets sur diverses substances comme la gélatine, l’œuf, le

lait, la caséine, etc.….
La possession d’hémolysines

Autres enzymes comme la tryptophanase, l’uréase , les
désaminases, les décarboxylases, les déshydrolases.
I-9-4 Métabolisme lipidique

Les lipides ne sont assimilables qu’après clivage et leur hydrolyse est assurée
par des enzymes qu’on désigne improprement sous le nom de lipase. Trois
groupes d’enzymes sont concernés.
Recherche des estérases
Principe :
On incorpore à une gélose contenant du chlorure de Ca2+, du Tween 80 qui
contient du monooléate de sorbitol.
La présence d’une estérase libérant des A.G transformés ultérieurement en sels

calciques insolubles se traduit par une opacification du milieu.
Technique
La gélose au Tween 80 est coulée en boîte de pétri et ensemencée en touches.
Après incubation à la tension de lato les souches estérases positive vont donner
un halo opaque due à la formation d’un précipite alors que les souches estérases
négatives ne donnent pas de précipité.
Recherche des lipases

Les lipases sont des enzymes capables d’hydrolyser les lipides.
La recherche se fait par l’hydrolyse d’un triacyl glycérol.
Exemple : Hydrolyse de la Tributyrine
La gélose de la tributyrine est coulée en boîte de Pétri et ensemencée en strie

radiale. Après incubation à 30°C les souches lipase positif donnent la présence
d’un halo clair.
Recherche leucithinases
Principe :
La leucithinase hydrolyse la leucithine en libérant le diglycéride et le
phosphotidyl-choline.
Technique
La gélose à base d’œuf est obtenue en ajoutant à une gélose nutritive à 10%, une
émulsion de jaune d’œuf stérile. Cette gélose est coulée en boîte de pétri et
ensemencée en strie. La présence de leucithinase va se traduire par la présence
de zone d’opacité très nette autour de la strie.
I-9-5 La respiration
La chaîne respiratoire est située au niveau de la membrane plasmatique. Elle est

constituée d’une succession d’enzymes et de coenzymes assurant le transfert
d’électrons d’un donneur vers un accepteur.

• Les enzymes respiratoires
- la cytochrome oxydase
- la catalase
- la nitrate réductase
• Le type respiratoire
L’étude du type respiratoire s’effectue en tube veillon rempli de gélose V.F.

Cette étude va permettre de classer les bactéries en 4 types respiratoires selon
leur comportement vis à vis de l’oxygène de l’air ainsi on aura :
- Les bactéries aérobies strictes qui exigent l’O 2 libre pour leur
développement
- les bactéries anaérobies strictes qui ne peuvent se développer qu’en

absence d’O2 libre
- les bactéries aérobies – anaérobies facultatifs qui peuvent se

développer avec ou sans oxygène
- les microaérophiles qui ne se développent qu’en présence d’une

faible quantité d’oxygène.


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• celle impliquée dans la dégradation de substrats avec production d’énergie

• celle impliquée dans la synthèse de nouvelles molécules nécessaires à la

L’ensemble de ces réactions est sous le contrôle de catalyseurs biologiques

De l’étude du métabolisme découlent plusieurs applications :

• la mise en évidence des besoins nutritifs des bactéries et des voies du

(la dégradation du substrat, la synthèse d’un produit final ou

METABOLISME BACTERIEN DANS L’ISOLEMENT ET L’IDENTIFICATION 1

- oxygène : les électrons sont transportés sur la chaîne des

- un substrat inorganique oxygéné comme les nitrates (respiration

La plupart des voies métaboliques produisant de l’énergie par oxydation d’un

I-1 Voie d’Embden –Meyerhoff

La glycolyse se divise en deux phases :

- la phase de remboursement qui est une oxydoréduction couplée à la

I-1-1 Les différentes étapes de la glycolyse (voir figure I)

• Phosphorylation du glucose en glucose 6 P

Cette réaction est catalysée par l’hexokinase ou le glucokinase. Elle est

L’hexokinase est présente dans de nombreux tissus et n’est pas spécifique au

• Isomérisation du glucose 6 P en fructose 6 P par la

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Le Glucose 6 P est un carrefour métabolique, le carbone 2 est le seul à avoir un

METABOLISME BACTERIEN DANS L’ISOLEMENT ET L’IDENTIFICATION 3

La phosphofructokinase catalyse la phosphorylation du fructose 6 P sur son

La PFK est l’enzyme la plus lente de la glycolyse. Elle catalyse l’étape

Elle est donc l’enzyme clé qui limite la vitesse de l’ensemble.

• Scission du fructose di P en trioses phosphate

Les carbones 4, 5 et 6 du fructose 1,6 di P ont donné le phosphoglycéraldéhyde.

• Isomérisation des trioses phosphates

Les deux trioses phosphates sont des isomères. La transformation du cétose en

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La phosphoglycéraldéhyde déshydrogénase catalyse l’oxydation du 3 P

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La phosphoglycérate mutase transforme le 3 P glycérate en 2 P glycérate. Elle a

Le mécanisme est de type ping-pong : l’enzyme phosphorylée au départ

Dans un 2ème temps l’enzyme déphosphorylée réagit avec le 1- 3 di P G pour

METABOLISME BACTERIEN DANS L’ISOLEMENT ET L’IDENTIFICATION 5

METABOLISME BACTERIEN DANS L’ISOLEMENT ET L’IDENTIFICATION 6

FRUCTOSE -6- PHOSPHATE

FRUCTOSE 1,6 -DIPHOSPHATE

Triose- phosphate isomérase

ACIDE 1,3 DIPHOSPHO-GLYCERIQUE

METABOLISME BACTERIEN DANS L’ISOLEMENT ET L’IDENTIFICATION 7

Figure I : LES ETAPES DE LA GLYCOLYSE

I-1-2 Métabolisation de l’acide pyruvique

Chez certains microorganismes, de l’éthanol est formé à partir du pyruvate.

- 1er temps : conversion du pyruvate en acétaldéhyde grâce à la

- 2ème temps : réduction de l’acétaldéhyde en éthanol grâce à un

Pyruvate décarboxylase Alcool déshydrogénase

Figure II : La fermentation alcoolique de l’acide pyruvique

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Le lactate est formé normalement à partir du pyruvate chez divers organismes.

CH3 – CO - COOH CH3 –CHOH - COOH

Figure III : La formation du lactate à partir du pyruvate

I-1-2-3 Oxydation du pyruvate en acétyle coenzyme A

Dans certaines conditions aérobies le NADHH+ est réoxydé dans la chaîne

I-1- 2-4Transformation de l’acide pyruvate en acide oxalo

Cette réaction est catalysée par la pyruvate carboxylase

CH3 – CO – COOH COOH – CH2 – CO – COOH

I-1-3 Bilan énergétique

1.1 GG6P - 1 ATP

F6P F 1,6 di P - 1ATP