BIOLOGIE

MOLECULAIRE
Dr Thérèse Samdapawindé KAGONE (tskagone@gmail.com,
70322412)
Dr André NAGALO(nagaloandre@yahoo.com, 71407137)
Pr Jacques SIMPORE
1
 PLAN DU COURS
Introduction - Historique
Chapitre I : La structure des acides nucléiques
Chapitre II: La Réplication de l’ADN
Chapitre III: La Transcription de l’ARN
Chapitre IV: La Synthèse protéique
Chapitre V: Mécanisme moléculaire du Cycle cellulaire
Chapitre VI: Les outils et techniques de la
génétique et de la biologie moléculaires
Chapitre VII: Les évènements génétiques
Chapitre VIII: Etude des polymorphismes
Chapitre IX: Diagnostic médical et Thérapie géniqu27e
3
274
Aujourd’hui, pour identifier des caractéristiques chez
des organismes vivants, qu’il s’agisse de bactéries,
d’animaux ou de plantes, on en analyse l’ADN.

On sait que cet ADN contient toute l’information qui

caractérise ces organismes. On sait extraire cet ADN
et l’analyser avec des techniques très faciles à
utiliser, souvent automatisées et qui donnent des
résultats en très peu de temps, souvent quelques
heures.

On peut ainsi détecter la présence d’agents

pathogènes, de résistances aux antibiotiques, ou
encore d’anomalies génétiques responsables de
maladies. 275
I - Connaissances préliminaires

5
 Membrane
Mitochondrie

Peroxysome

Vésicules

Appareil de Golgi
Noyau
Lysosome

Réticulum endoplasmique

I.1 – Structure d’une cellule animale

6
Organisme Cellules Chromosome ADN
gène
Séquence 5’... A A T T C C C G A A …3’
d’un gène
3’... T T A A G G G C T T …5’

I.2 – A la découverte du gène 7

G C

A T

G C

A T

I.3 – Structure de l’ADN

8
 1.4b 1.4c
ADN ARN
Protéine
1.4a
ARN viral

Rétro-virus

I.4 : Le dogme central de la Biologie

9
 Plasmide

I.5a – Schéma d’un plasmide

281
 Fourche
de réplication

Plasmides frères

Plasmide

I.5b – Réplication d’un plasmide

11
 Plasmides

ADN bactérien

Cellules filles

I.5c – Schéma de réplication d’une bactérie

possédant des plasmides
12
 HindIII
EcoRI
PvuI
tetR
ampR

BamHI

ori pBR322
Sal I

rop

I.5d – Schéma d’un plasmide :pBR 322

13
Tête Capside

Gaine contractile
Queue

Plateau

Figure I.6 : Structure d’un bactériophage

14
ENZYMES DE RESTRICTION
Définition et origine

üLes enzymes de restriction sont des endonucléases qui

coupent d’une manière définie et reproductible l’ADN double-
brin quelle que soit son origine. Elles ont permis de
caractériser un génome entier en une série de fragments
reproductibles.

üLes gènes ou fragments de gènes deviennent ainsi des

entités physiques isolables et non plus de l’information noyée
dans la masse du contenu génomique. Ces enzymes ont été
mis en évidence par le phénomène de la lysogénie.

15
üIl existe 3 types d'enzymes de restriction qui
diffèrent les unes des autres, par la localisation de
leur activité catalytique.
üEnzyme de type I: Ayant reconnu la séquence
cible, l'enzyme se déplace sur l'DNA et coupe de
manière aléatoire mille à quatre mille bases plus loin
(Système de boucles d’ADN ?).

üEnzyme de type II: L'enzyme coupe l'ADN au

niveau de la séquence reconnue.

üEnzyme de type III : L'enzyme reconnaît la

séquence cible et coupe la molécule de DNA 20 à 25
bases plus loin.
16
G A A T T C C C G A A T 1.8b
C T T A A G G G C T T A ADN vecteur

G A A T T C C C G

C T T A A G G G C

1.8a
T T C G A G C ADN tran sgène
C T C G A A G

1.8c
G A A T T C G A G C T T C C C G

C T T A A G C T C G A A G G G C

Figure I.8 : La technologie de l’ADN recombinant

17
 ADN
1.8a
Plasmide

1.8b

clonage 1.8c

Figure I.9 La technologie du clonage de l’ADN 289

ADNc
L’isolement de l’ARN poly A+ (poly adénine):

Dans la cellule eucaryote, il existe plusieurs

types d’ARN : l’ARN messager, l’ARN de transfert et
l’ARN ribosomal. La majeure partie des ARN
messagers des eucaryotes possède une queue
poly(A) rajoutée après le transcription et avant le
transfert vers le cytoplasme.

ARNm (eucaryote)
5’GGGAUCACUUGCGCAGCGCAUGCU(AAAAAAAAAA)n3’queue poly(A)

19
Le passage de l’ARN à l’ADN

üCette étape est toujours réalisée grâce à la

transcriptase reverse isolée d’un rétrovirus.

üLa synthèse de l’ADNc commence en 3’ de l’ARNm.

Cependant, la transcription par la transcriptase reverse
n’est pas parfaite, elle tend à baisser lorsqu’elle rencontre
des obstacles que sont les structures secondaires de
l’ARN.

üSi la molécule de l’ARNm est longue, la transcription

peut ne pas aboutir à l’extrémité 5’ à cause de la boucle
formée à cette extrémité par la transcriptase reverse. La
boucle est détruite par l’action de la nucléase S1.
20
 Processus de transformation: ARNm en ADN

ARNm

dNTP, ADN polymérase

Fig. IV.3 292

Extraction de l’ADN par le mélange phénol / chloroforme

Phase aqueuse
ADN (et ARN)

protéines
Phase organique
(Phénol; chloroforme)

Protéines (et lipides)

Extraction au phénol ou/et au chloroforme des protéines

22
 Méthode classique d’extraction de l’ADN
Cellules ou noyaux
Action d’un détergent:
Triton X-100 ou SDS ou
Sarcosyl…
Lyse des
Action d’une protéase:
membranes
Dissociation des protéines protéinase K par exemple
(dénaturation, hydrolyse)

Elimination: protéines, lipides Extraction sélective au

phénol-chloroforme

Précipitation sélective par

Précipitation de l’ADN
l’éthanol ou l’isopropanol

Lavage, séchage, redissolution

Elimination ’ARN
Digestion par une RNase
Conservation
23
Pureté : Spectre d’Absorption de l’ADN dans l’UV
*R = A260nm/A280nm

* ADN pur: 1,8 < R < 2

* ADN contaminé par les protéines: R < 1,7
* ADN contaminé par les ARN: R>2

absorbance

•280 nm à contamination protéine

•270 nm à contamination phénol
•230 nm à contamination glycides
- 320 nm: 0 à sans contamination

Longueur d’onde en nm
230 260 280 320

24
 I.2.3 – La PCR
La PCR (Polymerase Chain
Reaction), la réaction de
polymérisation en chaîne
consiste à amplifier
sélectivement une
séquence particulière
Thermocycler d’ADN par l’action répétée
standard d’une ADN polymérase.

Le fragment d’ADN à amplifier est compris entre deux

séquences (complémentaires des amorces) qui doivent
être connues et la longueur ne peut excéder 10 kb.
25
Processus:
Pour faire la PCR, on utilise l’ADN polymérase
d’une bactérie: Thermophilus acquaticus qui
vit à 75°C dans les eaux thermales. Cette
polymérase (Taq polymérase) est toujours
active à 94-96°C.
La réaction de la PCR comporte trois étapes
qui constituent un cycle au cours duquel la
quantité d’ADN à amplifier est doublée. Ces
cycles sont renouvelés entre 20 et 50 fois en
fonction de la quantité d’ADN cible de départ
et du but recherché. 297
1. la dénaturation de l’ADN à amplifier à
94°C,
2. l’hybridation avec une amorce,
appariement primer, annealing à 64°C
3. extension de l’amorce à 70 - 72°C par la
Taq polymérase.

L’amplification est effectuée par la répétition

des cycles qui assure une duplication
exponentielle de chaque brin.
27
La PCR est la méthode actuelle la plus
efficace et la plus rapide d’amplification d’un
ADN cible, c’est pourquoi elle est maintenant
largement utilisée.

Elle permet de mettre en œuvre les

techniques habituelles de génie génétique
même si l’on ne dispose au départ que d’une
faible quantité d’ADN.
28
Conditions de la PCR :

ü Dénaturation à 94°C à 7’ (1 cycle)

ü Dénaturation à 94ºC →40 s

ü Hybridation à 60ºC →45 s (35 cycles)
ü Extension à 72ºC →60 s

ü Extension finale 72°C à 15’

ü Conservation 4°C à ∞.
29
 3’ 5’
5’ 3’
94°C
I.10a
Les cycles de la PCR 3’ 5’

2à4à8à16à32à64à128à256 …

5’ 3’
Extension I.10b
3’ 5’ Appariement primer 64°C
5’ 3’ 5’
72°C 3’
3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’
I.10c
Les cycles de la PCR 301
Les amorces ou primers
Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des
amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle:
üen s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent
la région d’ADN à amplifier

üet avec leur extrémité 3' OH libre, servir

d’amorce pour l’ADN polymérase.

Les températures

Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont

effectuées à des températures différentes permettant
de302contrôler l’activité enzymatique :
üL’étape de dénaturation, est réalisée à environ 95°C,
pour une dissociation complète des deux brins d’ADN.

üL’étape d’hybridation se fait à une température qui

sera définie selon la nature des amorces (cette
température varie de 50 à 60°C). Cette température va
déterminer la stabilité des hybrides une fois que
l’appariement amorces / matrice est réalisé.

üL’étape de polymérisation est à environ 72°C,

température de « travail » de l’ADN polymérase
thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les
brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir
des extrémités 3’OH libre des amorces hybridées. 303
L’ADN polymérase
Les premières ADN polymérases utilisées provenaient
d'une bactérie thermophile (résistante à des
températures très élevées), comme par exemple
Thermophilus aquaticus (Taq polymérase).

De nos jours, les enzymes utilisées sont dites

recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur
obtention, et leurs propriétés ont été largement
modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles.

33
Le tampon
Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à
maintenir stable le pH du milieu réactionnel au
niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl
à pH basique 8,5 à 9).

Il contient des cations bivalents Mg2+,

cofacteurs indispensables pour la réaction de
polymérisation avec la Taq polymérase.

34
 Quelques variantes de la PCR
La PCR multiplexe
La PCR multiplexe est un protocole destiné à amplifier
plus d’un amplicon à la fois, par l'utilisation d'au moins
trois amorces par réaction de PCR.

Ses applications qualitatives sont nombreuses

(détection de souche virale, de mutations, …). 306
La PCR emboîtée ou Nested PCR
C’est une PCR en deux étapes successives, avec deux
couples d’amorce différents, le second liant des séquences
situées à l’intérieur du premier amplicon.

Elle est très utilisée par les

virologues travaillant sur les
virus à ARN qui peuvent avoir
une haute mutabilité. Le
premier couple d’amorces est
conçu pour pouvoir accrocher
les quelques parties stables
du génome viral, le deuxième
pour identifier le sous-type.
Elle permet aussi une
meilleure sensibilité du 307
résultat.
La RT-PCR
La RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) est une
technique qui associe une transcription inverse (RT)
suivie d’une PCR.

Elle permet de synthétiser le brin complémentaire d’un

ARN avec des désoxyribonucléotides en utilisant une
ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase
inverse). Cet ADNc est généralement destiné à être
amplifié par PCR

37
La Real Time PCR

38
La technologie de la PCR en temps réel est basée
sur la détection et la quantification d’un «reporter»
fluorescent.

L’augmentation du signal fluorescent est directement

proportionnelle à la quantité d’amplicons générés
durant la réaction de PCR. En observant la quantité
de fluorescence émise à chaque cycle, il devient
possible de suivre la réaction PCR durant sa phase
exponentielle où la première augmentation
significative dans la quantité d’amplicons est en
corrélation directe avec la quantité initiale de la
matrice originale cible (template)
39
Plusieurs instruments de PCR en temps réel sont
présentement sur le marché. Ces appareils utilisent
généralement un système en tubes fermés et la
quantification ne requiert aucune manipulation post-
amplification, ce qui minimise ou élimine les
problèmes de contamination par les amplicons suite à
la réaction de PCR et réduit le temps d’analyse.

Le processus complet est donc automatisé du début

à la fin rendant ainsi cette technologie intéressante
pour des applications d’analyses à grande échelle
(high-throughput).
40
 Technologies de détection
Il existe deux principes généraux pour la détection
quantitative des amplicons : les agents se liant à
l’ADN double brin (ex. SYBR Green I) et les sondes
fluorescentes.

Pour cette dernière catégorie, il existe présentement

quatre technologies principales : hydrolyse de sondes
(Taqman assay), hybridation de 2 sondes
(HybProbes), balises moléculaires (Molecular
Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers).
41
II.3 – Southern Blot
üC’est la méthode d’analyse de l’ADN imaginée par
Southern en 1975 pour visualiser les gènes ou toute
séquence d’un ADN génomique, par une hybridation
avec une sonde, marquée et spécifique, avec des
fragments de restriction d’ADN, préalablement
séparés par électrophorèse, dénaturés et transférés
sur une membrane. Le processus est le suivant:

v L’ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme

de restriction appropriée
vLes fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur
gel d’agarose,
v L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude,
42
üL’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par
capillarité sur un support solide (filtre de nitrocellulose
ou nylon). Les membranes de nylon sont les plus
utilisées car par un traitement au UV (254 nm), on
forme des liaisons covalentes entre le DNA et le
nylon de sorte que le support peut être utilisé fois
plusieurs avec d’autres sondes.

üLe support solide est hybridé avec une sonde

monobrin marquée à faible astringence puis lavé

üLe ou les fragments reconnus par la sonde sont

révélés par la technique de l’autoradiographie
43
44
Electrophorèse

Campbell, Biologie, DeBoeck 1995 p396 339

 Electrophorèse sur gel (agarose)

Gel prêt pour la migration Cuve d’électrophorèse BioRad

Moulage du gel

Photo du gel Gel sous UV Appareil Gene34F0lash

Les différents types d'électrophorèse utilisés dans les laboratoires de
biologie moléculaire, permettent de séparer les acides nucléiques en
fonction de leur taille:

● L'électrophorèse horizontale sur gel d'agarose permet de

séparer les fragments d'ADN de 300 à 10 000 paires de bases en
fonction de la concentration du gel en agarose

● L'électrophorèse verticale sur gel de polyacrilamide permet

de séparer les fragments d'ADN dont les longueurs vont de 1 à 1 000
nucléotides en fonction de la longueur du gel et de la tension appliquée
(de 1 000 à 2000 volts / cm).

● L’électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé

(PFGE) permet de séparer des fragments d'ADN double brin dont la
taille peut varier de 220 000 à 2 500 000 paires de bases. Cette
technique est aussi mise à profit pour la séparation des chromosomes
interphasiques. (PFGE pour Pulsed Field Gel Electrophoresis).
341
Électrophorèse sur gel d’agarose

Nagalo et al, 2011 345

Le Séquençage de l’ADN

49
II.4 – Le Séquençage de l’ADN
üIl a pour but la détermination de la séquence
nucléotidique de l’ADN isolé pour définir les introns,
les exons et les zones de régulation de l’ADN inséré
dans le vecteur.
Deux méthodes classiques sont alors utilisées:
ØLa méthode de Maxam-Gilbert: la méthode
chimique
Ø La méthode de Sanger: la méthode enzymatique

50
La méthode chimique.
üL’ADN double brin à séquencer est d’abord marqué
au 32P au niveau du phosphate en 5’.
üIl doit ensuite être digéré par une endonucléase de
restriction en deux fragments différents de taille, qui
sont séparés par électrophorèse.
üOn obtient ainsi un fragment dont une seule
extrémité 5’ est marquée.
üIl est séparé en 4 lots et dans chaque lot, au
moyen de réactifs chimiques différents, on réalise
une coupure au niveau d’un type de base différent.

51
üAprès électrophorèse sur gel de polyacrylamide
des 4 produits de réaction et autoradiographie, les
positions relatives des différentes bases sont
déduites de la comparaison des distances de
migration des fragments marqués en 5’.
üLa méthode de séquençage des acides nucléiques
de Maxam Gilbert : Un traitement chimique permet
de cliver spécifiquement au niveau de chaque base
qui produit alors des fragments radioactifs de tailles
différentes.
üLa séquence de l’ADN, lue directement de bas en
haut du gel, est alors : TGCACTTGAAC
52
 Séquence T C G A Lecture
32P-TGCACTTGAACG
G
32P-TGCACTTGAAC
C
32P-TGCACTTGAA
A
32P-TGCACTTGA
A
32P-TGCACTTG
G
32P-TGCACTT
T
32P-TGCACT
T
32P-TGCAC
C
32P-TGCA
A
32P-TGC
C
32P-TG
G
32P-T
T
Migration Séquençage: 5’-TGCACTTGAACG-3’ L3e5c0ture
La méthode de séquençage enzymatique
ü Elle a été mise au point par Sanger par
l’incorporation de didésoxyribonucléotides
terminateurs de chaîne et a été universellement
adoptée.
üCette méthode met à profit l’absence d’un hydroxyle
en 3’ d’un ddXTP qui ne permet pas la formation
d’une liaison phosphodiester.
üla conséquence est un arrêt de l’élongation
lorsqu’un didésoxyribonucléotide est incorporé dans
un brin d’ADN en synthèse. Ce phénomène est à la
base de la méthode de Sanger.
351
 Réplication interrompue
amorce
3’ 5’

5’ …TAAGTCA -----------------------------------------
ADN à séquencer

A C G T
4 dNTP 4 dNTP 4 dNTP 4 dNTP
+ ddATP + ddCTP + ddGTP + ddTTP
TGA TGAC TG T
TGACTTA TGACT
TGACTT

Electrophorèse en gel
de polyacrylamide A C G T

A
SENS DE T
MIGRATION SENS DE LECTURE
T (5’ à 3’) DU BRIN
C SYNTHETISE
A
G
T

Méthode enzymatique 352

L'automatisation du séquençage
üLa très grande majorité des séquences réalisées et
publiées aujourd'hui le sont grêce à des séquenceurs
automatiques. Ceux-ci sont capables de réaliser les
réactions de séquence, puis de les lire :
üPour cela, on marque les fragments d'ADN grâce à
des marqueurs fluorescents.
ü Une fois la réaction de séquence terminée, la taille
des fragments obtenus est déterminée par une
chromatographie
.

56
üLe séquenceur détecte la florescence sortant des
colonnes de chromatographie, repérant ainsi les
fragments d'ADN et leur taille précise.
üLes systèmes les plus m odernes permettent même
:
de lire les quatre nucléotides à partir d'une seule
colonne de chromatographie.
üLe résultat est présenté par la machine sous forme
de courbes présentant la fluorescence détectée, et
l'interprétation qui en faite en terme de nucléotides.
Pour exemple, voici un court extrait d'une telle
courbe

57
58
59
 Diagnostic cytogénétique
üLa cytogénétique est une discipline, développée en
1956 avec la détermination du nombre exact de
chromosomes chez l'homm. e.
üL’introduction en 1970 des techniques de
marquage en bandes des chromosomes a permis
l’amélioration de la résolution et la sensibilité de
l'analyse cytogénétique
ül'apparition de l' hybridation in situ fluorescente en
1986 nous offre aujourd'hui plusieurs outils
permettant une étude de plus en plus fine et précise
des chromosomes et de leur structure. 60
üLes chromosomes ne sont visibles qu’avec une
coloration spécifique pendant la métaphase du cycle
cellulaire.

61
üPendant la métaphase , les chromosomes
apparaissent constitués de deux bras
séparés par une zone étranglée appelée
centromère .
üLes bras ont une taille variable en fonction
des chromosomes, mais on reconnaît
toujours un bras court noté " p " et un bras
long noté " q ".

üChaque extrémité des chromosomes

prend le nom de télomère (il y a donc deux
télomères par chromosome).
62
üIl existe également des colorants fluorescents qui
permettent de visualiser spécifiquement l'ADN car ils
s'intercalent entre les bases de la double hélice.

Moutarde de
quinacrine

63
DAPI (4',6-diamino-2-phényl-indole) :

64
Iodure de Propidium

65
üCes colorants fluorescents sont essentiellement
employés dans le cadre de la cytogénétique
moléculaire ( hybridation in situ de sondes d'ADN sur
une préparation chromosomique)

üalors que le Giemsa est le colorant de base de

toutes les techniques de marquage en bandes des
chromosomes.

üIl existe deux principales techniques de marquage

en bandes des chromosomes ( banding ), utilisées en
routine
66
 FISH (Fluorescence In Situ Hybridation)

Dénombrement de chromosomes : mise en

évidence d'anomalie de nombre des chromosomes

67
ü On appelle anomalie chromosomique tout
remaniement du nombre ou de la structure des
chromosomes.
ü Ces remaniements peuvent s'observer de manière
constitutionnelle (ils sont alors présents dès la
naissance) soit de manière acquise au cours de
processus malins (ils ne sont observés alors qu'au
niveau des cellules tumorales).
üIls résultent d'un accident survenant soit au cours
de la méiose, soit au cours d'une mitose.
üIls peuvent impliquer un ou plusieurs
chromosomes.
68
Réarrangements touchant un seul chromosome

üInversion péricentrique : deux cassures sur le

chromosome, une de chaque côté du centromère.
Recollement après inversion du fragment
centromérique. Conséquence : modification de
l'indice centromérique du chromosome le plus
souvent.

üInversion paracentrique : deux cassures sur le

même bras chromosomique et recollement après
inversion du fragment. Pas de modification de l'indice
centromérique, cette anomalie ne peut être détectée
que par la modification des bandes chromosomiques.
69
Délétion : perte d'un fragment de chromosome. Il
s'agit toujours d'une anomalie déséquilibrée.

70
Duplication: présence en double exemplaire d'une
région chromosomique. Cette anomalie est toujours
déséquilibrée. La duplication est dite directe si le
fragment dupliqué conserve la même orientation que
le fragment d'origine, et inversée si le fragment
dupliqué a une orientation inverse.

71
trisomie 21 : 47 chromosomes par cellule, dont un
chromosome X et un chromosome Y, plus un
chromosome 21 surnuméraire :

72
Syndrome de Turner : 45,X c'est-à-dire 45
chromosomes par cellule, avec un seul gonosome
qui est un chromosome X :

73
translocation: 46,XX,t (1;18) c'est-à-dire 46
chromosomes par cellule, dont deux chromosomes X
et une translocation entre un chromosome 1 et un
chromosome 18.

74
Délétion

75
Trisomie X

76
Double Y

77
Conclusion

üLa FISH peut aider à la caractérisation des gènes

(oncogènes, gènes suppresseurs de tumeur)

üles hémopathies malignes et certaines tumeurs

solides peuvent se caractériser par un remaniement
chromosomique spécifique (translocation, inversion)

üla FISH peut aider à la surveillance de greffes de

moelle avec donneur de sexe différent par recherche
de chimérisme XX/XY

78
 La FISH rouge, verte, bleue, multicolore… connaît
désormais un succès qu’étaient loin d’imaginer les
cytogénéticiens dans les années 80.

De la peinture de chromosomes aux puces à ADN

basées sur le principe de la FISH, l’hybridation in situ
en fluorescence est actuellement en mesure de
répondre à une multitude de besoins, en recherche
comme en routine, dans les anomalies
constitutionnelles comme dans les anomalies
acquises.

79
La méthode de la FISH est habituellement simple et
rapide quoique parfois délicate.

Elle nécessite dans tous les cas une bonne

connaissance de la cytogénétique conventionnelle
pour une exploitation et une interprétation fiable.

La FISH est devenue un test d'analyse

chromosomique de complément indispensable dans
les laboratoires de cytogénétique et elle jouera dans
un avenir proche un rôle probablement prépondérant
grâce aux nouvelles applications technologiques.
80