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Planche (1)
Structure chimique de l’ADN

Configuration stéréochimique
de l’ADN (formes)
Z

B
A
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L’ADN :

1. Structure

L’ADN (Acide Désoxyribonucléique) double brin se présente sous la forme de deux chaînes de polydéoxynucléotides enroulées en double hélice. Chacune des
deux chaînes est constituée d’une alternance de sucres désoxyriboses et de phosphates associés par des liaisons phosphodiester. Une base parmi quatre est
portée par chaque sucre : l’adénine (A) ou la guanine (G), qui sont des purines, la thymine (T) ou la cytosine (C), qui sont des pyrimidines. L’ensemble base +
sucre + phosphate constitue l’élément de base de l’ADN, le nucléotide, sachant que l’ensemble Sucre + base = nucléoside liés par une liaison osidique. Les deux
chaînes sucre-phosphate de l’ADN sont maintenues associées par appariement spécifique entre les bases des nucléotides, A d’une chaîne avec T de l’autre
chaîne et G d’une chaîne avec C de l’autre chaîne. Cet appariement est assuré par des liaisons hydrogène. L’orientation des deux chaînes sucre-phosphate,
indiquée par la polarité 5’phosphate-3’ OH, est antiparallèle.
2. Formes

Historiquement trois formes de l’ADN double brin ont été décrites : les formes A, B et Z (planche 1).
L’ADN est souvent sous forme double brin mais il existe aussi sous d’autres états au cours de la vie de la cellule. En particulier, il a besoin que la double hélice
de l’ADN s’ouvre (dénaturation) lors de mécanismes comme la réplication, la transcription,… L’ADN est alors localement sous forme simple brin. L’ADN peut
aussi subir d’autres contraintes (étirement, compaction, …) lors des différentes phases du cycle cellulaire.
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La génomique :
Définitions :
Génome : Ensemble de l’information héréditaire d’un organisme, présente en
totalité dans chaque cellule
Taille du génome : la taille des génomes varie selon les espèces, elle est
mesurée en unités de milliers de nucléotides (kilobases kb) ou en millions de
paires de nucléotides (Mégabases Mb):
- Quelques dizaines de milliers de bases pour le génome d’un virus
- Quelques millions de bases pour une bactérie
- 3 milliards de bases pour le génome humain
-16 milliards de bases pour le génome du blé
Gène :
En 1939 Frederick Griffith a étudié Streptococcus pneumoniae virulente en
Base
non-virulente, en montrant que l’espèce virulente malgré qu’elle est tuée, elle
contient une substance qui peut transformer une espèce non-virulente en une
espèce virulente et cette virulence devient héréditaire et en 1944 Oswald et ses
collègues ont montré que c’est l’ADN qui est responsable du transfert des
caractères héréditaires.
Définition d’un gène :
1. Un gène est une région chromosomique capable d’engendrer un transcrit
fonctionnel ;
2. Séquence de nucléotides de l’acide désoxyribonucléique contant
l’information nécessaire pour la synthèse d’un acide ribonucléique ou d’une
protéine ;
3. Unité héréditaire de l’information correspondant à un segment d’ADN
transcrit en ARN et codant le plus souvent un polypeptide.
Vert : clair introns, Vert foncé : exons, blanc : espaces inter génique
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Le génome plasmidique :
Les plasmides sont des molécules symbiotiques qui ne peuvent survivre hors des cellules. Même si les plasmides n’appartiennent pas au système
opérationnel de base de leurs cellules hôtes, certains sont très complexes et portent de nombreux gènes. Il est donc approprié de qualifier leur ADN comme
« génome plasmidique ».
L’ADN des organites :
La majeure partie du génome eucaryote est contenue dans les chromosomes du noyau. Cependant, en plus de l’ADN nucléaire, certains organites cellulaires –
mitochondries et chloroplastes- contiennent également un type de chromosome qui leur est spécifique. Les chromosomes mitochondriaux et chloroplastiques
sont des molécules d’ADN double-brins ; et ils contiennent de multiples copies de leurs chromosomes.
Le génome viral :
Un virus est une particule non vivante qui ne peut se reproduire qu’en infectant une cellule vivante et en détournant la machinerie cellulaire de la cellule hôte
pour engendrer des particules virales filles. Les cellules des bactéries sont appelés « bactériophages ».
Le génome des procaryotes :
La plupart des procaryotes ont un génome contenu dans un seul chromosome, dans presque tous les cas ce chromosome est une double hélice d’ADN
circulaire fermée. Les gènes bactériens sont assez proches les uns aux autres, avec assez peu d’espace inter-génique et les introns sont extrêmement rares.
Le génome des eucaryotes :
La plupart des espèces eucaryotes sont classifiés en diploïdes, portant deux jeux de chromosomes nucléaires (deux copies de la fraction nucléaire du génome)
ou haploïdes, avec un seul jeu de chromosomes par noyau (la majorité des champignons et des algues sont haploïdes)
Expression d’un gène :
L’expression d’un gène est une suite de synthèses chimiques et de réactions
aboutissant à la production d’un acide ribonucléique ou d’une protéine.
• Dans un premier temps a lieu la synthèse d’un acide ribonucléique, dont la
séquence est complémentaire d’un des deux brins du gène donc identique à celle de
l’autre brin : c’est la transcription.
• La séquence de l’acide ribonucléique est identique à celle du brin sens et
orientée dans le même sens. Elle se construit de 5’ vers 3’ en complémentarité de
celle qui est « lue » sur le brin antisens.
• Après des réactions de maturation le transcrit primaire (RNA) devient RNA
messager (mRNA) et sort du noyau vers le cytoplasme.
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• Dans le second temps, le RNA messager est « lu » par groupe de trois nucléotides (lettres) grâce à un RNA complémentaire qui porte l’acide aminé
correspondant.
• La « lecture » du mRNA se fait de 5’ vers 3’ et la synthèse de la protéine se fait en même temps de l’extrémité NH2 terminale vers l’extrémité COOH
terminale.
• Après des réactions de maturation, la protéine « mature » est prête à remplir sa fonction dans la cellule.
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Les enzymes en génie génétique :

Polymérases Les DNA polymérases DNA polymérase DNA dépendante ou DNA polymérase - ADN polymerase I d’E.coli
- Taq Polymerase
DNA polymérase RNA dépendante : reverse transcriptase
Les familles des enzymes

Terminal transférase
Les ARN polymérases
Nucléases Les DNAses Les exonucléases
Les endonucléases
Les enzymes de restriction Type I
Type II
Type III
Les RNAses
Ligases
Phpsphatases
Kinases
Méthylases

Les enzymes de restriction :

Ce sont des enzymes, principalement d’origine bactérienne, capables de couper l’ADN double brin (quelque soit son origine) à des endroits spécifiques
(séquences nucléotidiques) appelés sites de restriction généralement de 4 à 8 paires de bases. Elles sont des endonucléases qui coupent la liaison
phosphodiester ; elles demandent de l’ATP et les ions du magnésium pour un bon fonctionnement.
Historique :
En 1965 W. Arber découvre que les bactéries infectés par des virus ont un moyen de défense contres ces parasites : elles découpent l’ADN viral en petits
morceaux grâce à des enzymes, véritables ciseaux moléculaires. Ces enzymes sont appelées « enzymes de restriction » ; elles ne coupent pas l’ADN n’importe
où, une enzyme donnée reconnait une séquence de bases spécifiques dans l’ADN, le site où elle découpe est appelé « site de restriction ». Différentes enzymes
ont été extraites de diverses bactéries ; on en connait aujourd’hui plus que 3000 enzyme !
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Nomenclature des enzymes de restriction :

Cette nomenclature dépend de règles spécifiques qui tiennent compte de la bactérie dont a été isolée l’enzyme de restriction :
• La première lettre, en majuscule, représente l’initiale du genre bactérien
• Les deux lettres, minuscules, qui suivent la première sont représentatives de l’espèce.
• Le chiffre romain qui suit ces trois lettres est le numéro d’ordre de découverte de l’enzyme pour la même bactérie source.
• La dernière lettre majuscule n’est pas obligatoire pour toutes les endonucléases de restriction. Elle est représentative de la souche de la bactérie d’où
l’enzyme a été isolée.
Exemples :
La bactérie : Escherichia coli Ry13
Les enzymes : EcoR I : première enzyme isolée chez Escherichia coli Ry13
EcoR V : cinquième enzyme isolée chez Escherichia coli Ry13
Palindrome : une séquence de nucléotides qui est lue de la même façon dans les deux directions, exemple : EcoRI.
Les enzymes de restriction vont hydrolyser l’ADN et donner différents types d’extrémités selon l’enzyme. On peut obtenir des « bouts cohésifs » appelés
aussi « collants » si l’enzyme coupe l’ADN de manière dissymétrique. D’autres enzymes peuvent générer des « bouts francs » si l’enzyme coupe l’ADN de
manière symétrique.

EcoRI PstI

5’ G 3’ 5’ AATTC 3’ 5’ CTGCA 3’ 5’ G 3’

3’ CTTAA 5’ G 5’ 3’ G 5’ 3’ ACGTC 5’

SmaI

5’ CCC 3’ 5’ GGG 3’

3’ GGG 5’ 3’ CCC 5’
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Digestion de l’ADN :
Tableau 1 : nomenclature de quelques enzymes de restriction
La digestion de l’ADN se fait généralement par multiples enzymes de restriction en
présence d’un tampon approprié. En générale on considère qu’une quantité de 1µg Enzyme Origine bactérienne Site de restriction
d’ADN est digérer par une unité d’enzyme pendant 1 heure à 37°C. Après la réaction on
ajoute l’EDTA. Sau II Staphylococcus aureus GAC/GTC
Alu I Athrobacter luteus AG/CT
Ava I Anabaena variabilis T C G A/G G
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G/GATCC
Bgl II Bacillus blobiggi A/GATCT
Eco RI Escherichia coli RY 13 G/AATTC
Unité d’activité d’une enzyme :
Eco RII Escherichia coli R245 C C A/T G G
C’est la quantité minimale d’enzyme nécessaire pour digérer totalement tous les
sites présents dans un microgramme d’ADN de référence (en générale du phage) en Hha I Haemophilus haemolyticus G G /C C
une (1) heure, dans les conditions optimales de fonctionnement de l’enzyme. Hind III Haemophilus influenzae A/AGCTT
′ ′
𝒕𝒂𝒊𝒍𝒍𝒆 𝒅𝒆 𝒍 𝑨𝑫𝑵𝒅𝒆 𝒓é𝒇é𝒓𝒆𝒏𝒄𝒆 𝐍𝐛 𝐝𝐞 𝐬𝐢𝐭𝐞𝐬 𝐝𝐚𝐧 𝐥 𝐀𝐃𝐍à 𝐝𝐢𝐠é𝐫𝐞𝐫
𝐔𝐧𝐢𝐭é 𝐝′𝐞𝐧𝐳𝐲𝐦𝐞 = × Hea III Haemophilus aegyptus GG/CC
𝒕𝒂𝒊𝒍𝒍𝒆 𝒅𝒆 𝒍′ 𝑨𝑫𝑵à 𝒅𝒊𝒈é𝒓𝒆𝒓 𝑵𝒃 𝒅𝒆 𝒔𝒊𝒕𝒆𝒔 𝒅𝒂𝒏𝒔 𝒍′ 𝑨𝑫𝑵𝒅𝒆 𝒓é𝒇é𝒓𝒆𝒏𝒄𝒆
Applications : Hpa II Haemophilus C/CGG
parainfluenzae
 Clonage et transgénèse
Mbo I Moraxella bovis GA/TC
 Carte de fragments de restriction
 Séquençage de l’ADN Pst I Providentia stuartii CTGCA/G

 PCR Sma I Serratia marcescens CCC/GGG

 Puces à ADN ; Taq I Thermophilus aquaticus T/CGA
 Construction de banque ADN génomique ou d’ADNc
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Électrophorèse sur gel d’agarose :

Est une technique de séparation des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose
est extrêmement utilisée en biologie moléculaire. L’ADN est chargé négativement à pH 7,
il peut se déplacer dans le gel sous l’action du champ électrique. Deux paramètres de séparation :
la taille et la structure tridimensionnelle de l’ADN.
Le gel d’agarose :
Le gel est composé de l’agarose qui forme un réseau régulier, sachant que la taille des mailles varie selon la concentration de l’agarose qui permet à des
faibles concentrations la migration de grosses molécules d’ADN et vis-vers-ca.