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Avantages
-Mutiplex → plusieurs gènes en même temps
(jusqu’à 800 gènes)
-Pas de réaction enzymatique (Transcription inverse,
PCR)
-Utilisation direction de l’échantillon, précision
accrue
-Comptage directe (digital et non pas analogique)
-Sensibilité
-Peu de temps « hands on » - Très peu de
manipulations à faire.
Technique :
Le système nCounter utilise une technique
numérique basée sur un code à barres
composé de fluorophores colorés. Il en
résulte une mesure multiplexée directe de
l’expression génique qui offre de hauts
niveaux de précision. La technologie utilise
des « codes-barres » moléculaires visualisés par l’imagerie de molécules uniques permettant de détecter et compter
des centaines de transcriptions uniques en une seule réaction. Chaque code à barres fluorescent est fixé à une sonde
spécifique ciblant à un gène d’intérêt.
Avantages :
3. RNA seq – Séquençage directe de l’ARN -Multiplex
Utilise le séquençage de nouvelle génération pour détecter la -Approche ouverte (pas nécessaire de définir
présence et la quantité de l’ARN dans un échantillon biologique à un les génes) – Découverte de nouveaux gènes
moment donné dans le temps. -Comptage directe
Méthode : On extrait les ARN d’une cellule et après on va les -Plage dynamique
convertir en ADN avec une enzyme transcriptase. Des ADN qui sont
séquences avec des techniques de ILUMINA.
Compter individuellement d’un fichier les traces d’ADN qui corresponde à ce qu’avant était dans l’ARN.
DESAVANTAGES : TRES CHER, DEMANDE DE CONNAISANCES DE BIO-INFORMATIQUE TRES PUISSANTES.
4. RNA FISH
Outil pour détecter l’ADN et l’ARN.
a) Fixation des cellules
b) Incubation des cellules avec de
sonde fluorescente
c) Ça va se coller dans les ARN
d) On va regarder les ARNm au
microscope
L’hybridation fluorescente in situ → FISH. C’est une technique qui utilise des sondes fluorescentes qui se lient à des
sites sur les chromosomes ou sur des ARNm par complémentarité de séquence. Le RNA FISH
s’intéresse à l’expression spatio-temporelle des gènes dans la cellule et dans les tissus.
II. Analyse du génome
1. Séquençage
Hybridation génomique comparative → Dans un organisme diploïde chaque segment
d’ADN peut être duplicat : une copie est présente sur chacun des deux chromosomes d’une
paire. Dans certaines pathologies le nombre de copies peut varier. L’hybridation génomique
comparative permet de diagnostiquer ces pathologies et d’identifier les régions
chromosomiques impliquées.
2. Puces à ADN
Même technique que pours
3. Marqueurs moléculaires
a) Polymorphisme de nucléotides uniques : changement d’une base à une position spécifique.
Méthode d’analyse : séquençage ou puces à oligonucléotides. Plus de 10 millions de SNP (séquençage) ont été
identifiés chez l’Homme. En général de 2 à 4 allèles possibles à chaque SNP – ETABLIR LES CARTES GENETIQUES.
b) Polymorphisme de longueurs de séquences simples : variation du nb de répétition d’une séquence courte.
Analyse par PCR ou transfert Southern.
Avantage : grand nombre de possibilité de répétition, donc la probabilité élevée d’hétérozygotes et 2 individus
pris au hasard dans une population sont fréquemment différentes.
4. DNA FISH
Etude de l’organisation du noyau
Diagnostic médical (cytogénétique)
Les chromosomes quand ils sont décompactés, ils gardent un espace bien précis. Avec cette technique qui utilisent
des sondes qui sont spécifiques à certains chromosomes, on peut visualiser quand ils sont en métaphase
(compaction maximale)
III. Analyse de bio-informatique
1. Séquençages génomiques → Archivage de data base, alignement de séquences, recherche de mutations, d’éléments
fonctionnels (cadre de lectures, site de liaisons, etc.), reconstruction du génome, etc.
2. Biologie structurelle
3. Bio – statistique
4. Biologie de population, phylogénie Edition de l’ADN Perte/change de fonction
5. Systems biology Transgénèse Gain de fonction
6. Traitement d’images Knockout Perte de fonction
7. Diagnostique Knock-in Changement de fonction
IV. Modification du génome – Génétique inverse Interférence à l’ARN Perte partielle de fonction
1. Etude fonctionnelle du génome
➔ Génétique classique : on obtient des organismes mutants présentant un phénotype différent, puis on identifie
les gènes impliqués.
➔ Génétique inverse : procédure partant d’une séquence d’ADN ou de protéine et visant à déterminer le
phénotype mutant correspondant
Deux approches :
• Mutagénèse dirigée : introduire une mutation choisie dans le gène correspondant
• Phénocopie : pas de mutation, mais perturbation de l’expression d’un gène. Même effet d’une mutation.
Réparation de l’ADN par recombinaison→ Machinerie enzymatique
capable de réparer l’ADN double brin . L’ADN cellulaire quand est
cassé peut être réparer de manière fidèle et nono fidèle. Une
coupure au milieu d’un gène se répare par une voie non fidèle et
devenir inactivée. Une autre voie de réparation fidèle à la séquence
originaire qui va correspondre correctement à l’ADN.
CRISPR et édition de l’ADN → Edition est soit une perte soit une substitution de la fonction.
Le système CRISPR-Cas9 peut être utilisé pour éditer les génomes (non-bactérien). Il suffit un ou deux
plasmides codant pour la protéine Cas9 (ribonucléases), l’enzyme Cas9 qui éffectue les coupures double
brin, et l’ARN guide sgrRNA
ZFNs TALENs Meganucleases CRISPR-Cas9
Difficile Modéré Difficile Facile
Protéine Protéine Protéine ARN
b) Knockout – Perte de fonction
On introduit des cellules embryonnaire souches modifiées dans un
blastocytes. Elles sont capables de faire toutes les cellules
souches. Si ce blastocyte arrive à la maturité on va obtenir des
souris mosaïques (consisté d’un tissu sauvage et génomique
modifiée).
L’ADN introduit dans les cellules ES peut s’intégrer au hasard.
Toutefois, si l’ADN introduit est similaire à une partie du génome
de la souris, il peut s’ensuivre une « recombinaison homologue »
de sorte que l’ADN s’intégrer en un seul exemplaire dans un site
spécifique. Les cellules ES knockout colonisent l’embryon hôte et contribuent souvent à la lignée germinale, ce
qui entraine la production des certains spermatozoïdes portant l’ADN modifié. Lorsque ces spermatozoïdes
fécondent un ovule normal, une souris knockout est obtenue.
Génération d’animaux homozygotes :
Il faut réaliser un croissement entres les individus
chimériques appelés G0 et un individu de phénotype
sauvage. Les individus G1 issues de ce croissement
n’hériteront du gène Ko-Ki-édité que dans le cas où la
cellule souche modifié ont engendrée la lignée germinale
des G0. Dans ce cas 50% des individus G1 seront
hétérozygotes. Par comparaison avec un groupe témoin,
on peut alors procéder à l’étude fonctionnelle des ces
souris Ko-KI-éditées qui ont deux copies modifiées pour
le gène d’intérêt.
Etapes :
✓ Production des petits ARN. Les enzymes coupent l’ARN double brin tous les 22 à 25 nucléotides
✓ Dégradation de l’ARN cible
Les petits ARN ont incorporé dans
un complexe protéines appelé RISC
L’ARN double brin est dissocié.
Reste l’antisens = guide
Si l’appariment est parfait :
coupure de l’ARNm → Dégradation
Si l’appariement n’est pas parfait
→ Coupure de l’ARN cible
INHIBITION DE LA TRADUCTION DE
L’ARNm CIBLE
Puces à ADN - Nanostring – Séquençage directe de
RNA FISH
Microarray Hybridation – barcodage l’ARN – ARN seq
Méthode Fixer sur une lame des Des codes de barres On extrait les ARN d’une « Hybridation
séquences d’ADN moléculaires visualisés cellule et les convertir en fluorescente in situ »
connues par l’imagerie de ADN par une enzyme
Obtenir les séquences molécules uniques TRANSCRIPTASE. Des Utilisation des sondes
d’ARN des cellules de permettant de compter ADN qui sont séquences fluorescente qui se lient à
cerveau et les marquer des centaines de avec des techniques de des sites sur les
avec fluorescence (V) transcriptions uniques en ILUMINA chromosomes ou sur des
Même chose avec les une seule réaction. ARNm par
cellules de foie et Chaque code à barres complémentarité de
fluorescence (R) fluorescent est fixé à une séquence.
Mélange de deux sur la sonde spécifique ciblant
puce un gène d’intérêt.
Résultat Les ARN vont se balader Mesure multiplexe Compter d’un ficher les Expression spatio-
et vont trouver son directe de l’expression traces d’ADN qui temporelle des gènes
complément (ARN et la génétique correspondait à ce dans la cellule et dans les
puce) qu’avant était l’ARN. tissus
Avantages Permet de quantité la Multiplex Multiplex
quantité d’ADN qu’on Pas de réactions Approche ouverte (pas
avait enzymatiques nécessaire de définir les
Savoir quels gènes sont Comptage directe gènes)
exprimés dans le Peu de manipulation à Comptage directe
cerveau, dans le foie et faire Plage dynamique
dans les deux
Désavantages Réactions enzymatiques Très cher
Comptage directe Demande de
Faible sensibilité connaissances de bio-
info très puissantes