PCR

POLYMERASE CHAIN REACTION

03/05/2023
05/03/2023 1 1
1 - Définition
PCR ou (polymerase chain reaction)
est l’amplification en chaîne par
polymérase

une technique basée sur la répétition

de réplications in vitro de l’ADN à partir
d’amorces spécifiques.

05/03/2023 2
2 - Historique
Mise au point en 1985 par KARY MULLIS (prix
Nobel en chimie en 1993),

la PCR est utilisée dans tous les laboratoires de

biologie moléculaire.

Son utilisation impose une organisation

particulière des laboratoires et une grande
expérience.

05/03/2023 3
3 - Applications
nombreuses, les plus courantes sont
- les recherches de délétions,
- la génération de sondes
- la préparation au sous-clonage,
- l’amplification des ARN et l’analyse de la
transcription illégitime
- la recherche de mutations,
- le séquençage,
- la recherche de virus, de bactéries, de parasites,
d’oncogènes ou de translocations

05/03/2023 4
4 - PRINCIPE

Le principe consiste à répliquer de façon

successive un brin d’ADN à partir d’une amorce
avec l’aide d’une enzyme d’ADN polymérases.

La réaction est réalisée dans un appareil

appelé THERMOCYCLEUR

05/03/2023 5
5 – Matériels et méthodes
5 – 1 – Matériels:

a – l’ADN à amplifier

b – les amorces ou PRIMERS:

Ce sont de petits brins d’ADN environ 15 à 20bases

capable de s’hybrider de façon spécifique avec l’ADN à
amplifier

05/03/2023 6
on utilise deux amorces

Une amorce anti sens pour le brin sens

Une amorce sens pour le brin anti sens

05/03/2023 7
5 – Matériels et méthodes
c – l’enzyme de réplication:

c’est une enzyme thermostable, provient de

microorganisme vivant de source chaude, une
bactérie thermophile = THERMOPHILUS
AQUATICUS donc l’enzyme s ’appelle TAQ
POLYMERASE
elle synthétise la chaine d’ADN à partir de
l’amorce

05/03/2023 8
5 – Matériels et méthodes
d – Mélanges de desoxynucléotides:

les quatre dNTP (dATP, dTTP, dCTP et dGTP)

qui serviront de substrats.

e – l’ion magnesium (Mg2+)

indispensable au fonctionnement de l’ADN

polymérase

05/03/2023 9
5 – 2 - méthodes
les 5 ingrédients sont mélangés dans un tube
d’analyse et soumis à différente cycle de
température

c’est une alternance de cycles comprenant

chacun 3 étape
1 cycle -------> 3étapes
- dénaturation
- hybridation
- extension ou élongation

05/03/2023 10
5 – 2 - méthodes

typiquement, PCR comprend entre 20 à 30

CYCLES voire 40cycles.

Le nombre de copies de la séquence est

doublée à chaque réplication (à chaque cycle).

05/03/2023 11
1 cycle comprend 3 étapes

Etape 1: dénaturation

- chauffage de l’ADN bicaténaire à une

température supérieure à sa température de fusion
(ou Tm, melting temperature) 95 à 98°C pour séparer
les deux brins ;

05/03/2023 12
1 cycle comprend 3 étapes

Etape 2: hybridation de l’ADN

avec les 2 amorces spécifiques à Tm 40 à 70°C ,

en présence des composants nécessaires à sa
réplication (amorces, Taq polymérase, nucléotides,
chlorure de magnésium, utilisé pour stabiliser à la
fois les nucléotides et la réaction, HCl ou KCl utilisés
pour maintenir le pH constant)

05/03/2023 13
1 cycle comprend 3 étapes

Etape 3: élongation ou extension

- Extension des amorces avec la Taq polymérase

thermostable (70 à 72°C)

NB: le temps d’élongation dépend de la taille du

fragment à amplifier et de la vitesse de
polymérisation de l’enzyme, la Taq polymérase
ajoute environ 1000 nucléotides par minute,

05/03/2023 14
Remarques:
- La durée et la T° des 3 réactions sont contrôlés
par l’appareil thermocycleur

- Ce n’est qu’à partir du 3eme cycle

qu’apparaissent les fragments amplifiés

- A la fin de chaque cycle, la quantité d’ADN a été

multiplié par 2 (amplification exponentielle 2n n =
nombre de cycle)

05/03/2023 15
Exemple:
Ex1: 1 cycle = 21 -------- > 2 ADN double brin
Ex2: 2 cycles = 22
Ex3: 3 cycles = 23

Ex4: 10 cycles = 210

Ex5: 35 cycles = 235 donne environ 34 milliards

34359738368 brins de DNA,
05/03/2023 16
05/03/2023 17
 1 – la PCR est une technique de la
biologie moléculaire découverte par

A – KARL BRIANT
B – KARL LEWIS
C – KARY MULLIS
D – KARY MULLAN

05/03/2023 18
 2 – la technique de PCR est mise au
point pour la première fois

A – en 1981
B – en 1982
C – en 1983
D – en 1984

05/03/2023 19
 3 – la PCR est une technique de
la biologie moléculaire basé sur

A – la dénaturation
B – la renaturation
C – la réplication
D – l’extension

05/03/2023 20
 4 – Sur l’ADN, les polymerases
sont des enzymes,

A – QUI COUPENT
B – QUI COLLENT
C – QUI MARQUENT
D – QUI REPLIQUENT

05/03/2023 21
 10 – pendant l’amplification génique
l’ion magnésium est indispensable

A – au appareil thermocycleur
B – au fonctionnement de Taq
polymérase
C – pour stabiliser la réaction et les
nucléotides
D – à la vitesse de polymérisation
05/03/2023 22
 15 – pendant la PCR, le temps
d’élongation dépend

A – de l’appareil thermocycleur
B – de la taille du fragment à amplifier
C – de la température de fusion
D – de la vitesse de polymérisation

05/03/2023 23