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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRETIQUE ET POPULAIREMINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEURE ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université des sciences et de la technologie Mohamed Boudiaf Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département socle commun de
biologie Chargée des cours Mme Cherifi F. 2019/2020

Chapitre 2 
4-Séquençage d’ADN

1-Extraction d’ADN

Tous les êtres vivants sont constitués de cellules qui elles-mêmes abritent
de l’information génétique sous forme d’ADN. Pour extraire cette
molécule, on doit d’abord procéder à l’une des techniques de broyage
déjà décrite.

La solution d’extraction doit contenir des enzymes et des détergents


chimiques afin d’éliminer les autres constituant de la cellule, on peut
alors le débarrasser des protéines qui l’accompagnent à l’aide d’une
protéase, mais cette étape n’est pas toujours nécessaire surtout si on ne
veut pas utiliser cette molécule (pour une électrophorèse ou le
séquençage d’ADN) par exemple).

Le broyat cellulaire doit être centrifugé afin d’éliminer les débris


cellulaires et récupérer le surnageant, généralement lors de l’extraction
de l’ADN, le surnageant est traité avec des alcools pour agglomérer les
filaments de l’ADN.

Une deuxième centrifugation à haute vitesse (de 10000 à13000T/min)est


nécessaire pour récupérer l’ADN.

2-POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

 Définition : c’est une technique permettant d’obtenir, à partir d’un


échantillon d’ADN, d’importante quantité d’une séquence d’ADN
spécifique.
 Principe: Technique basée sur la répétition de cycles de réplication
d’ADN, in vitro à partir d’amorces spécifiques, elle a été mise en
évidence en 1985,elle repose sur l’amplification d’ADN en présence
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d’enzymes purifiées et thermostable isolées à partir de Thermus


aquaticus « Taq polymerase » c’est une enzyme thermostable.
 Les étapes de la PCR 

Après extraction de L’ADN, ce dernier est soumis à un cycle


d’amplification qui comporte trois étape:

1. Dénaturation : c’est la séparation des deux


brins D’ADN obtenue par le chauffage du
mélange réactionel (jusqu’à 94 C°),à cette
température les liaisons d’hydrogène des
molécules d’ADN bicaténaire sont rompues ,
l’ADN devient monocaténaire.

2. Hybridation : en abaissant la température les


amorces spécifiques s’hybrident sur les
molécules simples brins d’ADN
complémentaires de la séquences d’ADN à
amplifier,il s’agit toujours d’un couple
d’amorces ,complémentaire encadrant le
fragment d’ADN à amplifier.

3.Élongation: C’est la synthèse du brin d’ADN


complémentaires , une enzymes polymérase, la Taq
polymerase ajoute à l’extrémité de l’amorce des
oligo-nucléotides présents dans le milieu de la
réaction .On obtient à chaque cycle 2n copies d’une
molécules d’ ADN ,

3-Méthode de Sanger

Principe : la méthode de Frederick Sanger est historiquement capitale


puisqu'elle a permis les premiers séquençages de génomes complets.

Définition du séquençage : il s’agit d’un ensemble de technique


permettant de connaitre l’enchainement des nucléotides et leur
emplacement dans le génome ou dans un fragment d’ADN.
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Technique : La polymérase nécessitant un court fragment


complémentaire du brin à séquencer pour initier la synthèse du brin copie.

La méthode de séquençage de Sanger utilisait une amorce marquée ou


non marquée.

Quatre réactions de séquençage sont donc menées en parallèle dans


quatre tubes distincts, contenant chacun un seul didésoxyribonucléotide
(ddTTP, ddATP, ddCTP et ddGTP) :

NB : Les ddTtp, ddATP ,ddCTP et ddGTP sont des nucléotides avec


un oxygène en moins au groupement phosphate, ils n’ont pas la capacité
de se lier au nucléotides suivant lors de la synthèse du deuxième brin.

 ADN matrice + amorce marquée + dNTP + ddTTP.


 ADN matrice + amorce marquée + dNTP + ddATP.
 ADN matrice + amorce marquée + dNTP + ddCTP.
 ADN matrice + amorce marquée + dNTP + ddGTP.
La synthèse du deuxième brin se fait en tube ,l’orsque la Taq
polymérase utilise l’un des nucléotides ddTtp, ddATP ,ddCTP et ddGTP
la chaines de synthèse s’arrête en formant des fragment qui seront
analyser par l’électrophorèse, la séquence sera établie selon les résultat de
l’électrophorèse. Ex : ATTGCG les possibilités d’hybridation seront
comme suit :

 TAACGC
 T*
 TA*
 TAA*
 TAAC*
 TAACG*
 TAACGC*
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Méthode de SANGER