Corrigé TD2 Génie Génétique

Epreuve Session de Janvier 2014

Question 2

Vous souhaitez cloner la séquence codant le facteur IX non maturé dans le vecteur pENTRTM
1A (Figure S2) au niveau des sites de restriction Xmn I et Not I (Figure S2.b).
a) Indiquez les différentes étapes vous permettant d’obtenir le vecteur recombiné en
partant d’une banque d’ADN complémentaire établie à partir d’hépatocytes humains.
Donnez la séquence des amorces de PCR utilisées pour la production de « l’insert ».
b) Expliquez le principe de sélection des clones bactériens transformés avec le plasmide
recombiné.

a) La production d’un vecteur recombiné se déroule en 3 temps :

- La production de l’insert que l’on va amplifier par PCR
- La linéarisation du plasmide
- L’hybridation de notre GI et du plasmide afin d’avoir un vecteur recombiné

Design de l’amorce :
L’insert est notre gène d’intérêt (GI), c’est-à-dire le gène codant le facteur IX (cf. Annexes Figure S1)
avec les amorces. On commence par repérer la séquence codant le facteur IX que l’on veut cloner (soit
CDS). On sait que le facteur IX est non maturé, c’est-à-dire que l’on garde le peptide signal car
l’épissage n’a pas encore été fait. La séquence à amplifier va donc du 30ème nucléotide au 1415.

Etape 1 : On dénature l’ADN pour obtenir des matrices simple brin

5’ ATGCAG ------------------------------------------------------ACTTAA 3’

3’ TACGTC -------------------------------------------------------TGAATT 5’

5’ ATGCAG ------------------------------------------------------ACTTAA 3’

3’ TACGTC -------------------------------------------------------TGAATT 5’

Etape 2 : On commence le design des amorces (en vert) pour chacun des brins. N’oublions pas que
l’ADN polymérase synthétise un brin complémentaire de 5’ vers 3’.
TGAATT
5’ ATGCAG ------------------------------------------------------ACTTAA 3’

3’ TACGTC -------------------------------------------------------TGAATT 5’

ATGCAG

Etape 3 : Maintenant il nous reste juste à rajouter les séquences reconnues par les enzymes de
restriction (en bleu) ! Nous allons en effet insérer notre GI dans le plasmide pENTR1A, en utilisant les
enzymes XmnI et NotI (cf. Annexes Figure S2)
TGAATTCGCCGGCG
5’ ATGCAG ------------------------------------------------------ACTTAA 3’

TACGTC -------------------------------------------------------TGAATT
3’ 5’

GAANNNNTTCATGCAG
 Nous avons désigné nos amorces sur une quinzaine de nucléotides (les amorces font entre 15 et 30
nucléotides normalement) ! Maintenant écrivons-les dans le sens de la polymérase de 5’ vers 3’. Petite
astuce : la séquence que l’on doit écrire à l’envers (celle d’en haut) est l’amorce anti-sens !

Amorce sens : GAANNNNTTCATGCAG

Amorce anti-sens : GCGGCCGCTTAAGT

Production de l’insert :
Dans un tube à PCR nous allons introduire, notre ADN qui contient le gène codant le facteur IX humain
(cf. Annexes Figure S1), auquel nous allons rajouter nos amorces, des dNTPs (mélange des 4
désoxyribonucléotides A, T, C et G), ainsi qu’une ADN polymérase. (Ainsi que de l’eau, des tampons
enzymes et du MgCl2)
Nous plaçons notre mélange dans un thermocycleur qui va effectuer la PCR (dénaturation,
hybridation, élongation).

Nous vérifions par électrophorèse sur gel d’agarose que la réaction d’amplification a bien eu lieu.

Enfin, nous allons purifier le fragment de gène qui nous intéresse afin d’éliminer l’excès de nucléotides
(dNTPs). Cette étape se fera sur une mini colonne de silice, grâce à des solutions de lavage.

Digestion du plasmide :
Le plasmide doit être digéré par les endonucléases XmnI et NotI, afin de le rendre linéaire et de créer
les extrémités cohésives adéquates à l’insertion du GI lors de l’hybridation.
Nous plaçons donc notre plasmide purifié en présence des endonucléases, le tout à l’incubateur (37°c),
c’est-à-dire dans les conditions idéales pour les endonucléases.

Nous vérifions que le plasmide a bien été linéarisé par électrophorèse sur gel d’agarose.

Création de l’hybride : GI + plasmide

Nous avons donc notre gène d’intérêt d’un côté et notre plasmide pENTR1A de l’autre. Nous voulons
cloner notre GI dans le plasmide.
Nous les rassemblons dans un tube eppendorf, et laissons incuber.
Notre clone est prêt et pourra être inséré dans une cellule, en vue de sa multiplication !

b) A cette étape nous avons déjà effectué la transformation bactérienne. Le plasmide recombiné a été
intégré à la cellule bactérienne.
Observons attentivement notre plasmide pENTR1A
Nous avons 2 outils de sélection :
- Le gène ccdB, qui a été normalement remplacé par notre gène d’intérêt si l’hybridation s’est faite
normalement. (cf. Annexes Figure S2 b)). La protéine ccdB exprimée est bactéricide car elle va
bloquer le travail de l’ADN Gyrase (= topoisomérase spécifique des bactéries).
- Le gène de résistance à la kanamycine KmR, qui reste de toute façon sur le plasmide recombiné.

pENTR1A
Dans le mélange réactionnel nous avons :

- Les bactéries ayant ingéré le plasmide recombiné, avec la résistance à la kanamycine

- Les bactéries ayant ingéré le plasmide non recombiné, avec le gène ccdB
- Les bactéries n’ayant rien ingéré

On ajoute de la Kanamycine à notre mélange.

- Seules les bactéries possédant le gène de résistance à la Kanamycine et ayant donc ingéré le
plasmide pENTR1A survivront.
- Les bactéries avec le plasmide non recombiné, et donc ayant conservé le gène ccdB, mourront.
- Les bactéries n’ayant rien ingéré n’ont pas de résistance à la kanamycine et donc mourront.

Question 3

En vue de l’expression de la protéine dans une cellule eucaryote, vous souhaitez transférer la
séquence codant le facteur IX sur le plasmide pDEST 12.2 (Figure S3).
a) Comment peut-on réaliser ce transfert sans utiliser d’enzymes de restriction ?
b) Comment réalisez-vous le clonage, la sélection puis l’amplification du plasmide
recombiné (avec l’insert) ? Précisez le type cellulaire utilisé pour ce clonage.
c) Donnez la structure générale du plasmide recombiné.

a) Si vous avez bien observé la carte du vecteur pENTR1A, vous avez dû remarquer la présence de 2 sites
particulièrement intéressants : les sites attL1 et attL2.
Observez également la carte du vecteur pDEST (cf. Annexes Figure S3). Là encore nous trouvons 2 sites
attR1 et attR2.
Et qui dit sites att, dit système Gateway ! Nous n’utiliserons plus d’enzymes de restrictions, mais des
clonases!

Nous vous invitons à revoir le schéma résumé du système Gateway ci-dessous.

b) Le clonage :
Dans la question 2, nous avons créé notre vecteur d’entrée, avec le GI, les 2 sites attL, et la résistance
à la kanamycine conservée. Une fois passées les étapes de multiplication bactérienne, puis de lyse
cellulaire afin de récupérer notre plasmide recombiné, c’est-à-dire notre vecteur d’entrée, nous allons
le mettre en présence d’un plasmide de destination, pDEST. Sur le schéma récapitulatif ci-dessous,
cette étape correspond à l’étape 2.
A l’aide d’une LR Clonase, enzyme spécifique du système Gateway, le fragment jaune sur le schéma
contenant notre GI, va prendre la place du fragment bleu contenant le gène ccdB, tout simplement !

pENTR = vecteur d’entrée : site attL

pDEST = vecteur de destination : site attR

La sélection :
Nous effectuons alors une transformation (c’est-à-dire que la cellule rendue compétente va ingérer
nos plasmides obtenus à la fin de l’étape 2 sur le schéma). Nous verrons plus bas, de quel type de
cellule il s’agit.

Dans le mélange réactionnel nous avons donc :

- Les cellules ayant ingéré le plasmide d’expression recombiné, avec la résistance à l’ampicilline
cette fois-ci (observez bien la carte du vecteur pDEST cf. Annexes Figure S3)
- Les cellules ayant ingéré le plasmide pENTR1A recombiné avec le gène ccdB, et la résistance à la
kanamycine
- Les cellules ayant ingéré le plasmide pDEST non recombiné et qui possède toujours le gène ccdB
- Les cellules ayant ingéré le plasmide pENTR1A non recombiné et qui possède la résistance à la
kanamycine
(Rq : le rendement du système Gateway est très élevé ; aussi il est très peu probable que les
plasmides n’aient pas été recombinés)
- Les cellules n’ayant rien ingéré

On ajoute cette fois-ci de l’ampicilline à notre mélange. Toutes nos cellules vont mourir, soit par
absence de résistance à l’ampicilline, soit à cause de la protéine bactéricide ccdB. Toutes, sauf celles
ayant ingéré le plasmide d’expression recombiné avec notre GI !

L’amplification :
Une fois nos cellules sélectionnées, nous allons les laisser se multiplier : c’est l’étape de culture
cellulaire. Pour cela nous allons placer nos cellules dans :
 un endroit strictement stérile et le restant
 un incubateur remplissant les conditions nécessaires à la vie des cellules
 un milieu de culture qui varie selon le type de cellule et ce que l'on veut en faire.

Quel type cellulaire ?

Là, nous sommes à l’étape où nous voulons exprimer le gène, c’est-à-dire produire la protéine
correspondante. Il faut donc commencer par transcrire l’ADN en ARN grâce à une ARN polymérase
L’ARN polymérase a besoin d’un promoteur pour démarrer la transcription. Vous avez remarqué que
sur le premier plasmide utilisé, le pENTR1A, il n’y avait aucun promoteur, c’est pour cela que nous ne
l’utilisons jamais pour l’expression.
Observons maintenant le plasmide pDEST. Y a-t-il un promoteur ?
 Oui, le promoteur CMV ! Ce plasmide peut donc bien nous servir à la transcription.
Cependant, nous avions vu en cours que le promoteur P(CMV) du cytomégalovirus était reconnu par
l’ARN polymérase de cellules de mammifères. Nous utiliserons donc des cellules eucaryotes !

c) Structure générale du plasmide recombiné

attB1 attB2
GI

Promoteur CMV