Les vecteurs de clonage

On appelle l'ADN dans lequel on insère 'e fragment d'ADN a

ADN étranger étudier CADN inséré est insert cu
Cette seguence nucléotidique est capable de s'auto-rdpliquar.
Les vecteurs sant donc des petits ADN dans lesquels an Insère un fragment d'ADN que l'an veut étudier
Ces
petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages. II est nécessaire d'introduire ces
bactériophages ou plasmides dans les bactéries pour réaliser une multiplication de ceux-c[

I- Les plasmides
Ce sont des molécules d'ADN extra chromosomiques trouvées naturellement dans les bactéries _
. L'ADN plasmidiquû est circulaire, double brin et super La taille de ces plasmides
peut varier de 2 200 kb. Le plasmide très sauvent un au plusieurs gênes de résistance à un antibiotique (ou une
drogue), cc qui permet de repérer leur présence. II possède une origine de réplic%iiall indépendante celle
chromosome" de l'hôte. Ces origines de réplication detcrminent nombre de copies d'un même plasmide dans une
cellule {peut varier de I à 700 copies,'cellule). Les plasmides permettent de Glaner des fragments d'ADN double brin
dune langueur maximale de 10 kb

I.IL Préparation des plasmides

'es bactéries contenant les plasmides sont mises en culture dans un gr*nd volume (jusqu'à 2 litres milieu de
culture). Quand la concentration bactérienne atteint une valeur suffisante. an traite par un antibiotique (comme
chloramphénicol) qui empêche 'a croissance bactérienne sans affecter la réplication plasmides. On récupère les
bactéries par centrifugation. Puig, on perméabilise la paroi bectèrienne par un traiternent doux permettant
d'obtenir un passage en solution des plasmides qui scat plus légers que l'ADN bactérien La purification des
plasmides peut Otra ensuite réalisée par chromatographie liquide à haute performance CLI LlitrF'— centrifugation
en gradient de densité.

un exemple de plasmide: 'e buc19

plasmide classique est le puCIg_ La séquence complète est connue nucléotides). II comporte particularités
suivantes:
- un gêne de résistance l'ampicilline (antibiotiqueL La présence de ce gène permettra à la hactér;e porte;_ de ce
plasmide do ne pas être sensible à de cet antibiotique
- Le gene Sac Z gui pour la p-galactosidese dans l'opéron
Enfin, une région avec des sites multiples et uniques pour des enzymes de restriction connues. est
appelée " palylinker Son est de permeure l';nsertiorl du fragment d'ADN étra.%ger.
Ce type de plasmide est intéressant car il niontre
un systèF,e sélection des bactéries ayant été transformoes par plesmtdes recombinants.
un system appaflenant à l'opéran lactose peut étre utilisé à la place d'un secarld
antibiotique. L'insertion r]'ADN dans le plasmide PLIC à finactivation du gén2 qui
cade pour la e-gglactosidasa Pour présence l'absence de "activité enzymatique alactasidase, utilise un
galacloside dont la couleur pa.#+_• de au quand il est clive par la alactosidase, ce camnasé s'appelle X-
ga[ pour pouvoir métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée un inducteur, cet Induraleur est le 'PTG
(isopropylt,hio-p-r qaiactnsir/e)
En culture et en présence d'IPTG et de X-gal, les bactéries résistantes à l'ampicilline at transformées par les
plasmides recombinants se présentent sous farrns de colonies blanchâtres cer elles ont pycl•a la capacité clivage de
l'équivalent coloré Ciu lactose (la X-gal) par la e-qalactosidase Par co.-.tre: les bactéries regista;ltes i'zmpicilline et
non transtormees par [es plasmides recombinants se présentent forme de co*onies La sélection visuelle des
bactéries transformées par les plasrnidet Œcombinwlts est donc possibl&

1.3/. Avantages et désavantages des plasmides

Avantages:
- Petite taille du vecteur, permettant un travail exporimental aisé.
- Sélection des plasmides recombinants (sélection par les antibiotiques).
Désavantages:
- Faibleetficac(te pour la transformation des bgcléries (pénétration de
plasmides), - impossibilité d'insercr des larges fragments d’ADN

2- Les bactérioohaqes

Les bactériophages contiennent de l’ADN sous la forme simple brin ou double brin.
Les bactériophages de type lambda (48.5 kb pour le bactériophage h sauvage)
présentent. Eux. Un génome sous 12 forme ADN doubla brin Cet ADN peut
 - Soit s’intégrer de façr,n stable dans le génome de 12 becterie : « cycle
lyŒogénique’

- Soit se multiplier et con«uire à la formation de nombreuses particules

phagiques par utilisation de la machinerie cellulaire de la bactérie, ce qui conduit à
la mort de la cellule hôte « cycle lytique ».

- Dans les bactériophages utilisés comme vecteur de clonage, seul le lytique

est impotant_ La partie centrale du génome, contenant les genes nécessaires au
cycle lysogène sera donc délétée et remplacée par l’ADN à cloner, qui pourra alors
être amplifié lors du cycle lytique du bactéri’phaqë

Le seule limitation de cc systéme ré&de dans 12 langueur du fragment qui peut être
introduit dans le phage. La (aille totale de l’ADN recombinant obtenu doit être
entre 850/0 et 105 % de la taille du génome originel afin que l’encapsidation
(assemblage du génome et de l’enveloppe du phage ou « capside ») de cet ADN soit
possible et que le cycle lytique puisse se produira Les bactériophages peuvent ainsi
porter des fragments de kb environ.

2.1/. Avantaqcs et désavantages des phages Avantages :

La taille des fragments d’ADN insérables est supérieure celle des plasmides (40-50
Rb)

La transformation des bactéries (ëincorporation des phages) est plus efficace que
pour las plasmides. Désavantages :

Nombre de sites de restriction restreints dans le génome des phages.

Obligation d’empaqueter l’ADN ntraintes de taille pour l’ADN insérer

3. Les cosmides

Ce sont des vecteurs hybrides portant à la fois

- Des sdquences d’origine phasique permettant laur encapsidalion in vitro

(séquences cos) des « quences d’origine plasmidiqua gène de résistance un
antibiotique et séquence permettant au plasmide de Se répliquer dans une
bactérie un simple plasmide (séquence ori).

Ceci permet de se dispenser des rtgians essentielles de l’ADN du phage et de

construire des ADN recombinants portant Lisqu’à 45 kb d’ADN étranger

2.1 !_ Avantaqes et désavantages des cosmideg Avantagos :

T2iIIe des fragments insérables peut atteindre 50 kE

Leur incarpalsticrl dans les bacteries (transformation) est plus efficace-que pour les
plasmides. Aosavantages ;

Obligation d’empaqueter l’ADN.

4- Les YAC (Yeast Artificial Chromosomos)

Ces vecteurs de clonages peuvent se présenter sous deux formes : une forme
circulaire, permettant Ea manipulation chez E. Cali (et en particulier l’insertion
d’ADN exogène et san amplification ils possèdent une séquence ori Et un gans de
résistance à un antibiotique) et une forme linéaire, Obtenue après Coupure gaml-il
st EcaRI et qui permet d’obtenir les deux « bras » du YAC Ces deux tras ‘ontienneni
les télomères (TE une oiûine de réplication levure (ARS) un centromère (CEN) ainsi
que dos gènes (LIRA et TRP) utilisés pour la sélection des ciones_ La lig2tion de ces
bras à un très grand fragment d’ADN étranger (humain par ex) à 1000 kb) extrait de
cellules en culture la transforme en pseudo chromosome de levure Capable après
dans ce micra«organisme de Se répliquer (grâce à ARS), de stabiliser ses extrémitàs
(grâce aux séquences TEL) et de se lépartir entre les cellules filles 101 E da la division
cellulaire (grâce à la sequence CEN).