15.02.

2016

La réplication
I. Présentation de la réplication
Définition : le paradigme est un modèle cohérent de vision du monde qui repose sur une base définie
(ce à quoi on croit en biologie moléculaire). L’information génétique est formulée par un texte, le
génome, écrit dans un alphabet de quatre lettes : A, T, G et C. L’intérêt de cette information est à
terme de se traduire sous une forme différente afin d’induire l’apparition de protéines (enzymes et
structurales) qui jouent des rôles importants. L’ADN n’est donc qu’un support, le génotype, qui se
traduit par l’expression des protéines au niveau du phénotype.
Cependant, les protéines ne sont pas directement traduites de l’ADN : il a été créé un intermédiaire,
l’ARN. Il va éviter de mettre en danger l’information génétique et va amplifier un signal (chaque ARN
sert à la synthèse d’un grand nombre de protéines).
Pour passer de l’ADN à l’ARN on utilise la transcription (on ne change pas l’alphabet mais son
support).
On traduit ensuite le langage de l’ARN au langage de 20 acides aminés pour synthétiser les protéines.

Tout part donc de l’ADN. Il faut donc un mécanisme permettant de dupliquer l’information génétique
pour créer de nouvelles cellules. La réplication permet de créer deux copies identiques.
Réplication : mécanisme conduisant à la duplication de l’ADN permettant la transmission de
l’information génétique d’une cellule mère à deux cellules filles.
II. Le modèle de la réplication : expérience de Meselson et Stahl
A. Les trois modèles hypothétiques de la réplication
1. Conservation de la molécule parentale et molécule néo-synthétisée.
2. Réplication dispersive : deux molécules filles hybrides car seulement certaines parties de la
molécule parentale servent à la synthèse.
3. Réplication semi-conservative : seulement un des deux brins est issue de la molécule parentale,
l’autre est néo synthétisé.
Masalson et Stahl ont utilisé les caractéristiques de l’ADN léger et lourd pour comprendre quel
modèle était le bon.

B. La réplication obéit à un processus semi-conservatif

Bactéries qui poussent sur un milieu contenant de l’azote 14N. Ils font la différence entre de l’ADN
plus ou moins dense avec une composition d’azote léger 14N et d’azote lourd 15N. Si on fait le
mélange, on observe une migration intermédiaire de l’ADN, donc on obtient un ADN hybride.
Ils ont été capables de synchroniser les bactéries (synthèse de l’ADN au même moment), afin
d’obtenir une seule forme d’ADN. Au bout d’une génération après avoir ajouté l’azote 14, l’azote 15
a disparu au profit d’un ADN hybride. En laissant dans un milieu d’azote léger, l’’hybride disparaissait
peu à peu pour devenir léger.
Ils ont ainsi pu distinguer le bon modèle entre les trois.

III. Les ADN polymérases : fonctions et propriétés

A. La réaction de polymérisation
La synthèse d’ADN se fait toujours à l’extrémité 3’ comme pour les ARN. On dira que la
polymérisation se fait dans le sens 5’ vers 3’. Formation d’une liaison phosphoester avec l’attaque
nucléophile du 3’OH de l’ADN simple brin qui ajoute un nouveau nucléotide, qui forme une nouvelle
extrémité 3’OH.

Il faut ajouter des dNTP qui permettent de former la réaction entre l’ADN polymérase et l’ADN simple
brin. Il faut une amorce dont le rôle est joué par l’ADN polymérase. L’ADN simple brin sert de
matrice, c’est lui qui est copié. Il ne faut plus que des oligonucléotides pour synthétiser l’ADN. L’ADN
polymérase de fixe sur l’amorce de la matrice qui a une extrémité 3’OH libre. A chaque incorporation
de nucléotide, il y a libération de molécules de pyrophosphate (phosphates β et gamma du
nucléoside triphosphate). C’est une réaction fortement exergonique (très spontanée) : les molécules
libérées sont rapidement hydrolysées en phosphates inorganiques, ce qui rend la réaction de
polymérisation irréversible.
-> désoxyribonucléotide
-> complémentarité des paires de bases
Alors seulement il y a la réaction catalytique.
B. Activités des ADN polymérases
Chez escherichia coli, il y a cinq ADN polymérase ; on s’intéressera à l’ADN polymérase I et III.

1. L’ADN polymérase I d’E. Coli

Découverte en 1957, elle contient plusieurs activités catalytiques. Elle est en grande quantité dans
les bactéries.
Sa première activité est la synthèse d’ADN (en présence d’une matrice, d’une amorce à 3’OH et de
dNTP).

a. Activité exonucléasique de 3’ vers 5’

Si on utilise une matrice, de l’ADN polymérase, une amorce mais qu’on enlève du dNTP, on se rend
compte que l’ADN polymérase va dégrader l’ADN de l’extrémité 3’ vers 5’ (activité exonucléasique).
Elle va ainsi libérer deux types de nucléotides : des didésoxynucléotides ou des
désoxyribonucléotides. Cette activité devient forme si on a un mésappariement dans l’ADN (erreur
d’incorporation, etc) car il y a une distorsion du site actif. Cette activité permet ainsi la correction des
erreurs de la synthèse de l’ADN.

b. Activité exonucléasique de 5’ vers 3’

Activation de l’activité de 5’ vers 3’ pour une matrice partiellement double brin. Elle peut
complètement remplacer un brin mais n’est pas capable de lier deux brins. Cette fonction intervient
dans la suppression de certains fragments. Cela correspond à la dégradation d’un brin et de son
remplacement -> activité de déplacement de brèche.

Trois activité : polymérase, exonucléasique 3’ -> 5’ ou 5’ -> 3’.

Elle synthétise très lentement l’ADN et s’en sépare après avoir fait une dizaine de nucléotides : elle
est distributive (se decroche souvent pour changer de matrice ou se remettre sur la même matrice).

2. L’ADN polymérase III d’E.Coli

a. Processivité et distributivité des polymérases
Elle se caractérise par une processivité extrêmement importante : nombre de nucléotides incorporés
avant que l’ADN polymérase se détache de la matrice. Exemple : ADN polymérase III holoenzyme >
500 000 nucléotides. Il y a deux catégories d’ADN polymérase III :
- core (minimum pour faire de la synthèse in vitro car possède les activités catalytiques bien que pas
rapide ni processive)
- holoenzyme (forme un gros complexe avec d’autres protéines)

D’une manière générale, les enzymes de réplication sont processives et les enzymes de réparation
sont distributives.
b. L’ADN poly III : holoenzyme et core enzyme
- principale enzyme de réplication chez E. Coli
- rapide (250-1000 nucléotides/s) et hautement processive

Enzyme core : trois polypeptides issus de trois gènes différents : α, upsilon, β. La sous-unité α est
responsable de la synthèse de l’ADN. Upsilon possède l’activité exonucléasique correctrice de 3’ vers
5’. Se rajoutent des sous-unités pour former l’holoenzyme :
- le clamp β (pince glissante) augmente la processivité et la vitesse, en se cicularisant autour de
l’ADN. Il est responsable de maintenir l’ADN polymérase sur son substrat. Le clamp laisse une couche
possible pour les molécules d’eau ce qui lui permet de glisser le long de la double hélice. Elle se fixe
uniquement à l’ADN polymérase III.
- le clamp loader (ou chargeur d’anneau glissant) qui se fixe à l’ADN polymérase III et transfert le
clamp sur le core en utilisant l’énergie de l’ATP. Il ouvre ainsi le clamp β et le place au niveau d’une
jonction amorce-matrice. La protéine To permet de dimériser les ADN polymérase holoenzyme ->
deux activités polymérases, exonucléasiques … mais un seul chargeur de clamp complexe gamma. On
a deux ADN polymérases afin de répliquer les deux brins simultanément au niveau d’une fourche.

IV. La primase (DnaG)

Elle est responsable de la synthèse de l’amorce. Elle synthétise donc un ARN afin d’initier la synthèse
d’ADN.

V. Fonctionnement de la réplication
A. Le réplicon
Expériences génétiques sur les mutants : la réplication de l’ADN se faisait via deux intervenants. Le
réplicateur, un endroit fixe dans le génome avec une origine de réplication. Une protéine initiateur,
codée par un gêne différent du réplicateur, qui allait controler l’activation au niveau de l’origine.
Réplicon : ensemble de l’ADN répliqué à partir d’une seule origine.

B. Contraintes liées au sens de la réplication

1. Progression des fourches de réplication
La réplication est-elle uni ou bidirectionnelle ? Soit on a deux fourches de réplication, soit une origine
avec un sens seulement. Des manipulations avec des nucléotides radioactifs ont été réalisées :
incubation de bactéries dans des milieux soit moyennement radioactifs tout d’abord, soit des milieux
radioactifs. Si on fait une autoradiographie, on va obtenir des grains plus ou moins sombres.
L’incorporation dans la bulle, au milieu, a été synthétisée avant les extrémités. Cela signifie que la
réplication est bidirectionnelle. Les deux brins sont synthétisés de manière simultanée.

2. Les fragments d’Okazaki

Problème d’orientation : la synthèse est dans les deux sens, mais uniquement de 5’ vers 3’ ? La
synthèse sur un des brins se fait de manière continue (5’ -> 3’) et sur l’autre de manière discontinue
car le brin est mal orienté. Pour le brin discontinu, il faut plusieurs amorces d’ARN.
Une fourchette de réplication, 2 sens ? L’enzyme responsable du brin continu suit l’ouverture de la
double hélice. La deuxième sous-unité va dans le sens contraire ; l’ADN bouge alors au cœur de l’ADN
polymérase qui, elle, est fixée (conformation en trombone).

C. Les autres protéines associées à la réplication (ou accessoires)

1. L’hélicase (dnaB)
Son rôle est de casser la double hélice de l’ADN ou de l’ouvrir. L’ADN hélicase va former un anneau
autour d’un ADN simple brin. Elle se déplace alors de 5’ vers 3’. Une hélicase ne viendra enchasser
qu’un ADN simple brin. Une fois placée, elle ouvrira la double hélice en cassant les liaisons
hydrogène.

2. Les protéines de liaison aux simples brins (SSB)

L’ADN simple brin est maintenu par les protéines SSB pour les empêcher de reformer une double
hélice, ça sert de protection pour favoriser la synthèse d’ADN.
Les SSB sont extrêmement conservées au cours de l’évolution. La protéine permet d’optimiser le
fonctionnement de l’hélicase.

3. Fonctions des topoisomérases

Elles sont responsables d’enlever les contraintes topologiques qui apparaissent devant une fourche
de réplication. Elles enlèvent les tensions dans l’ADN et gèrent les niveaux d’enroulement (le nombre
de topoisomères). Il y en a deux grands types :
- de type I
- de type II (ADN gyrase)
Elles contrôlent la structure topologique de l’ADN : elles génèrent des coupures transitoires,
catalysent le passage des segments d’ADN à travers ces coupures et referment ces coupures.
Toutes les topoisomérases connues ont deux caractéristiques :
- elles sont capables de couper et de reformer une liaison phosphodiester de l’ADN par
l’intermédiaire de deux réactions de trans-estérification. Au cours de l’étape de clivage, il se forme
un intermédiaire covalent ADN-enzyme entre le groupement hydroxyl d’une tyrosine au centre actif
de l’enzyme et le phosphate de l’ADN au niveau de la coupure.
- la coupure transitoire permet le passage d’un segment d’ADN simple brin ou double brin.

a. Les topoisomérases de type I

Enzyme monomérique qui forme un complexe covalent entre l’enzyme et l’ADN. Cela libère
l’extrémité 3’OH.
b. De type II
Elles ont deux sites actifs, on a besoin d’ATP nécessaire pour entrainer les changements de
conformation de l’enzyme. La gyrase est indispensable à la réplication pour contrer les supertours.
Elles peuvent également séparer deux ADN entremêlés.

4.

5. L’ADN lignase

Rappels :
C’est a 260nm que l’on observe le changement d’absorbance en fonction de la structure de l’ADN
(hyperpromicité). Point d’inflexion : 50% de l’ADN est sous forme dénaturée, cad simple brin. On
détermine grâce à lui le TM (température de fusion) de l’ADN. Ce qui fait varier : le pourcentage de
GC et la longueur de l’acide nucléique. Plus le double brin est long, plus il faut d’énergie et donc de
chaleur pour le dénaturer. Enfin, la concentration en ions positifs (chaque brin chargé négativement
se repousse si la concentration en sels baisse).

Plasmide en présence d’exonucléase : reste sous forme de plasmide car elle a besoin d’une extrémité
libre et accessible pour fonctionner.

La fidélité d’une ADN polymérase est le résultat :

- du taux d’erreurs effectuées lors de la synthèse (complémentarité des bases)
- de l’efficacité de relecture par l’activité exonucléase 3’->5’

L’ADN ne peut faire la jointure et a besoin d’une activité particulière de l’ADN ligase : elle fait le joint
entre les deux extrémités (3’ et 5’). Elle va donc juste créer une liaison phosphoester entre les deux
nucléotides adjacents. Elle agit sur de l’ADN donc sur des régions double brin (elle ne peut lier deux
ARN). Elle nécessite un cofacteurs cad une source d’énergie (NAD+ ou variable comme de l’ATP, de
l’ADP …). Réaction séquentielle entre activation de l’enzyme et de l’extrémité 5’P.
On transfère un groupement adénine sur l’enzyme. On active l’extrémité 5’P.
Les ADN ligase interviennent dans la réplication (ligature des trous entre les extrémités 3’ et 5’ mais
ne peuvent fonctionner que si le trou comporte les extrémités. Très utilisé in vitro aussi pour le
clonage).

L’élongation
-> les étapes de la réplication. Rôle de l’hélicase qui avec de l’énergie sépare les deux brins en cassant
les liaisons hydrogène. En amont de la fourche, on génère des supercourbes positives (torsions) qu’ils
faut relacher. On a alors l’ADN gyrase qui relache d’ADN. On sépare alors les brins. Il faut les protéger
(du fait qu’ils se referment ou qu’ils forment des hybrides intrabrins) : c’est le rôle de la protéine SSB
qui est capable de se lier à l’ADN simple brin. L’ADN polymérase peut alors lire les différentes paires
de bases. Nécessité de la synthèse d’une amorce pour la synthèse : ARN synthétisé par la primase
(ARN polymérase particulière), qui libère l’extrémité 3’OH. L’ADN polymérase peut alors se fixer et
entamer la synthèse.
Deux types de synthèse : continue avec une seule amorce d’ARN et l’ADN polymérase suit l’ouverture
de la double hélice, et discontinue avec les fragments d’Okazaki (orientation spécifique). L’ADN
polymérase 1 est recrutée au niveau de la fonction entre l’amorce et la fin d’un fragment. Elle
dégrade l’amorce d’ARN et la remplace par de l’ADN. Il y a alors un trou car pas capable de lier les
deux bouts. Pour clore les fragments d’Okazaki, on a besoin de l’ADN ligase qui utilise de l’ATP ou du
NAD+.

L’initiation
Cinq sites avec neuf nucléotides responsables de la fixation de la protéine dnaA.
Séquences GATC : lorsque l’ADN est doublement méthylé, la réplication peut avoir lieu.
Particularité : recrutement lorsqu’une protéine DnaA est fixée (liaison coopérative). Elle forme une
structure où l’ADN s’enroule autour d’elle. Une fois qu’on a un ADN simple brin on peut charger
l’hélicase. En s’enroulant autour du complexe de DnaA, l’ADN entraine l’ouverture de la double
hélice, ce qui permet de commencer l’activité.

La terminaison
Avant qu’elles soient séparées, entremêlement des deux molécules d’ADN. Ce sont les caténanes
(chaines). Donc problème car les deux génomes doivent être séparés. Il faut donc faire une réaction
de décaténations en coupant les deux brins de l’ADN et faire passer l’autre molécule à travers la
coupure. Il faut donc des ADN topoisomérases de type II (ou pour E. Coli de type IV). C’est un modèle
théta.

F. La réplication chez les eucaryotes

Notre ADN est fragmenté (plusieurs chromosomes linéaires) et condensé en chromatine. Il faut ainsi
désassembler les histones etc. De plus, il y a des aspects temporels : réplication en quelques heures
pour un ADN plus grand et plus complexe pendant la phase S.

Les aspects temporels :

Interphase (G1, S, G2) et phase de mitose responsable de la division et de la répartition du matériel
génétique. G1 décide si la cellule se divise ou se différencie, elle prépare donc la phase S pendant
laquelle il y a une synthèse d’ADN (6-8h). La phase G2 commence avec la synthèse d’ADN terminée et
prépare la mitose.
La phase S doit donc permettre le doublement précis de la quantité d’ADN dans un temps donné.

1. Origine de réplication
On observe plusieurs yeux de réplication chez les chromosomes linéaires : il y a donc plusieurs
origines de réplication qui vont lui permettre de copier l’ensemble de l’ADN dans un temps imparti. Il
y a donc plusieurs unités et donc plusieurs réplicons (toutes les 30 000 – 300 000 paires de bases).
Après la fusion des bulles, chaque fourche de réplication s’inactivera et disparaitra.
Sachant que la vitesse d’une fourche = 2000pdb/min, c’est long donc plusieurs unité de réplication.
Chez les eucaryotes, toutes les origines de réplication ne sont pas initiées au même moment, cela
diffère de l’euchromatine (vite ouvert) et de l’hétérochromatine (tardif).

Les aspects structuraux :

Il faut desassembler les nucléosomes et les rassembler par la suite. Ces contraintes sont
caractéristiques des eucaryotes.

Comme chez les procaryotes, on a plusieurs ADN polymérases. La première responsable de la

synthèse d’amorces (polymérase α), complexe multiprotéique avec deux activités primase qui crée
une amorce ARN et ADN polymérase qui prolonge l’amorce par de l’ADN. Cette enzyme est peu
processive, donc il faut d’autres enzymes : les ADN polymérases réplicatives delta (brin discontinu) et
epsilon (brin continu).

2. Comparaison de l’étape d’initiation entre procaryotes et eucaryotes

Chez les eucaryotes, plusieurs protéines sont impliquées et le complexe de pré-réplication se forme
immédiatement après la mitose. Il correspond à une protéine ORC qui reconnait un fixe de fixation
sur l’ADN marquant l’origine de réplication, + une séquence riche en AT afin d’ouvrir la double hélice.
Orc n’ouvre pas la double hélice mais recrute d’autres protéines et en particulier des chargeurs
d’hélicases pour former le complexe. Il est forme sur toutes les origines de réplications, activées ou
pas. C’est l’activation de l’hélicase qui ouvre la double hélice. Après le système est similaire :
synthèse d’une amorce (polymérase α + primase).

3. La réplication de l’extrémité des chromosomes : les télomères

Deux fonctions : protection et contrôle du nombre de réplications possibles.
Problème : pas de moyen de combler l’endroit de l’amorce ARN. C’est le télomère avec une structure
particulière : une séquence répétée tout le long. Or, au bout d’un moment, les chromosomes se
raccourcissent. De plus, l’ADN télomérique a un rôle de protecteur d’ADN. Plus l’extrémité se
raccourci, moins elle protège et la partie interne risque d’être dégradée -> crise, la cellule meurt. Une
cellule peut donc se diviser environ 30 ou 50 fois, puis meurt. La longueur du télomère régule donc le
vieillissement des cellules, organismes, etc. A partir de là, recherche sur la fonction et le maintien du
télomère.
Il se caractérise par la répétition d’une même séquence, d’abord double brin puis ensuite simple brin.
En fonction des organismes la séquence varie. Au microscope, on observe une boucle (T-loop),
comme un lasso. Elle repose sur l’existence de ces séquences répétées capables de s’hybrider. Pour
protéger de la digestion et de la dégradation les extrémités, la partie simple brin vient déplacer le
brin de la partie double pour forme une structure en double hélice.
Télomérase : ADN polymérase et riboprotéine = ARN. Cette structure est un composant
indispensable, elle régenère les télomères.
L’ARN sert de matrice pour l’activité de la télomérase (prolongement de l’extrémité 3’). Elle se
déplace et rallonge la partie simple brin du télomère.
Extrémité 3’OH = substrat, qui a besoin d’une matrice pour se prolonger. Utilisation de l’ARN comme
matrice pour synthétiser de l’ADN -> transcriptase inverse.

Résumé : comment régénérer la longuer des télomères ?

La télomérase ralonge le simple brin, la réplication est initiée par la primase qui rallonge l’extrémité
des chromosomes. Cette activité n’existe que dans les cellules immortelles.