Techniques générales d’étude du génome humain normal et

pathologique

I. Interaction Génome-Environnement
• Le phénotype de l’Homme résulte d’un génome, d’un environnement
(alimentation, émotions, mol génotoxique, xénobiotiques (🡪
médicaments, mol apportés par l’environnement qui interagissent avec
le génome) et des interactions entre ce génome et l’environnement.
Chacun a son propre génome, tandis que les environnements peuvent
être différents ou communs à des individus. Le génome a été séquencé
totalement depuis 2004.
• La définition d’un gène (utilisée par le Comité de Nomenclature du
Génome Humain) est : segment d’ADN qui contribue à une fonction ou
un phénotype (expression du génotype).

II. Les variations du génome

• Maladies monogéniques : altération sur un gène (ex : mucoviscidose : gène CFTR codant pour canal Cl-).
- Plus de 6000 maladies monogéniques référencées
3 6
- Fréquence faible : 1/10 à 1/10 voire moins.
- La protéine n’est pas toujours connue (10 à 20% des cas).

• Maladies multifactorielles :
- Profil de polymorphisme (petites variations du génome)
- Facteurs environnementaux(la plupart des maladies actuelles) ➔ Exemple des pathologies chroniques :
diabète de type 2, HTA, cancer…
- Ce même profil de polymorphisme dans un autre environnement n’amène pas forcément la pathologie

1. Les gènes de susceptibilités

• Un gène de susceptibilité est un gène qui, combiné à l’action d’autres facteurs (génétiques, environnementaux),
peut être responsable d’une maladie.
• Un gène de susceptibilité pour une maladie ne pourra pas à lui seul causer l’affection, toutefois sa présence
augmente le risque pour l’individu de développer la maladie. Il faut d’autres facteurs de risque (surtout
environnementaux) pour déclencher une pathologie.
• Exemple du gène BRCA1 (17q) impliqué dans la réparation de l’ADN. On a recensé plus de 8 000 mutations, il est
en effet muté dans 16% des cancers du sein et 39% des cancers de l’ovaire chez les femmes de moins de 50 ans. Il
y a donc une augmentation du risque avec la mutation mais elle n’est pas suffisante (implication d’autres
facteurs).

2. Les maladies multifactorielles

• Les maladies dites multifactorielles présentent les caractéristiques suivantes :
- Il existe une tendance familiale certaine.
- Mais leur transmission au sein d’une famille n’est pas compatible avec une hérédité de type maladie
monogénique (suppose la coexistence d’autres altérations géniques éventuelles associées à des facteurs
environnementaux)
• Ces maladies multifactorielles impliquent très souvent la présence simultanée de nombreux allèles de gènes
différents et ayant chacun un effet limité.

1
• Chacun de ces variants génétiques, considéré isolément, n’est ni indispensable ni suffisant pour entrainer la
maladie. Au contraire, celle-ci n’apparait que lorsqu’un certain « seuil » de susceptibilité est dépassé et ce seuil
peut être atteint par l’action conjointe de facteurs génétiques (diverses combinaisons d’allèles correspondant à
plusieurs gènes) et de facteurs environnementaux. Le diabète de type 2 en est un exemple.

3. Les facteurs environnementaux

Facteurs environnementaux :
o Macro-environnement : social, économique, culturel (croyances, rituels), expositions à des facteurs de risques
o Environnement : agents physiques (rayonnements ionisants), chimiques (médicaments), biologiques.
o Microenvironnement : cellule, un type cellulaire peut impacter sur un autre au sein d’un tissu
o Nano-environnement : molécule, interaction d’une molécule sur une autre (surtout ADN)
Interaction génome-environnement qui génère :
• Modifications géniques 🡪 remplacement d’un nucléotide par un autre, transmissibles aux cellules filles et
irréversibles.
• Modification épigénétiques 🡪 pas de modification de la séquence, mais modification de paramètre du
génome / de la structure de l’ADN, transmissible aux cellules filles, mais réversibles car implique des
mécanismes enzymatiques (déphosphatase…) :
▪ Méthylation de l’ADN, en particulier sur les bases cytosines (CpG) qui modifient le phénotype. Les
cytosines méthylés ne peuvent plus lier les facteurs de transcription donc pas de transcription.
▪ Acétylation, méthylation et phosphorylation des histones : expression ou non du gène.
▪ Remodelage de la chromatine : accessibilité modifiée donc modifie l’expression du génome.
Ces processus sont catalysés par des enzymes et sont donc réversibles.

4. Les polymorphismes (variations du génome)

o Concernent des séquences uniques ou modérément répétées.
o Polymorphisme bi-allélique (2 allèles possibles) ou multi-allélique (jusqu'à 10).
o Insertion/ délétion de 1 à plusieurs centaines de nucléotides.
o Changement d’un seul nucléotide sans modification du cadre de lecture par 3 AA (ORF) : SNP ou Single
Nucléotide polymorphisme : + de 10 millions dans le génome (qui font qu’on est tous différents), soit 1/200 à
1/1000 pb.
o Grandes variations en fonction de l’origine ethnique (caucasien, africain, asiatique) 🡪 polymorphismes
particuliers mais qui tendent à s’homogénéiser comme tout le monde couche ensemble.

a) Les différents types de polymorphismes

99,9% des séquences d’ADN sont identiques d’un individu à l’autre.
Sur les 0,1% de différence, plus de 80% sont des SNPs (Single
Nucleotid Polymorphism).
• SNP : changement d’un nucléotide pour un autre.
• Mutation ponctuelle : principale source de variation dans le
génome.
• On ne retrouve pas toujours les mêmes polymorphismes pour un même gène selon les différentes ethnies.

b) Les SNP
- La très grande majorité des SNP sont localisés en dehors des gènes (dans les séquences non codantes donc
pas d’impact, en tout cas connu).
- 22000 SNP se situent dans des séquences exoniques (exons = séquences codantes)
- 10 000 SNP modifient l’acide aminé (nsSNP = non synonymous SNP), cependant il peut être du même type
(basique, acide) qui ne modifie pas la fonction globale de la protéine
- Environ 2 000 nsSNP modifient les fonctions de la protéine.
- Auxquels il faut ajouter environ 1 000 modifications par Insertion ou Délétion

2
🡪 Conséquences
- Silencieux : pas de modification des fonctions de la protéine.
- Altération directe des fonctions de la protéine par modification d’un acide aminé, d’un site d’épissage
(influence sur la maturation de l’ARN), création d’un codon stop🡪 UAA, UAG, UGA (protéine tronquée),
variants…
- Altération indirecte par modification de séquences régulatrices (modification quantitative ➔ influence sur
l’ARN polymérase ➔ plus ou moins d’ARN produit donc plus ou moins de protéine produite).

c) Intérêts de la connaissance des polymorphismes de l’ADN

o Métabolisme des médicaments : les médicaments sont métabolisés dans l’organisme grâce à des enzymes
(protéines) codées par des gènes pouvant avoir un polymorphisme. On aura donc une efficacité, toxicité
différente en fonction des individus.
o Réparation des altérations (polymorphisme impliqué dans les gènes de réponse) de l’ADN induites par les
chimiothérapies anticancéreuses (le cancer est une maladie de l’ADN donc on induit des altérations de l’ADN
pour tuer la cellule mais le génome est équipé de système de reconnaissance et de réparation de ces altérations
➔ si le polymorphisme de réparation est efficace la chimio l’est moins…).
o Prédisposition à des pathologies tumorales ou non tumorales
o Réponse spécifique à l’environnement en fonction du profil de polymorphismes : réponse à ce qu’on mange par
exemple

5. Les mutations ponctuelles de l’ADN

• Au niveau moléculaire c’est identique aux polymorphismes mais les conséquences seront différentes.
• La mutation est :
- Neutre si elle ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine (du à la dégénérescence du
code génétique 🡪 un aa par plusieurs codons)
- Faux-sens si elle entraine la modification de la séquence en acide aminés de la protéine.
- Non-sens si elle entraine l’apparition d’un codon « stop » qui interrompt la traduction, avec synthèse
d’une protéine tronquée (raccourcie) donc qui perd ses fonctions dans la cellule.

• La mutation ponctuelle non-sens dans le gène de la β-globine (un des gènes servant à la fabrication de
l’hémoglobine). Le remplacement d’une seule base, C par T au niveau du codon 39 du gène de la β globine
provoque l’incorporation d’un codon stop à la place de la glutamine, et donc l’arrêt de la synthèse avec
expression d’une protéine tronquée.
• Ceci aboutit à une maladie, la β thalassémie, caractérisée par un défaut de biosynthèse de l’hémoglobine.
Portion du gène de la β-globuline : … CCAG… ➔ … CTAG … … GGTC… ➔ … GATC …
Séquence de protéine β-globuline : … glutamine… ➔ … stop

III. Les techniques d’études des SNP et des mutations ponctuelles

Pour étudier des SNP et des mutations ponctuelles, il y a des méthodes de références (séquençage, PCR-RFLP,
PCR-extension d’amorce), ainsi que d’autres méthodes qui ne sont pas de référence (SSCP, DGGE, dHPLC, HRM).

Une méthode de référence est une technique permettant de connaître de façon précise la séquence nucléotidique.
Les méthodes qui ne sont pas de référence (longue et cher) mettent en évidence un comportement différent des
séquences sauvages et mutées dans des conditions physico-chimiques particulières.
13 14
• Le corps humain est composé d’environ 10 - 10 de cellules pouvant se différencier, se regroupe pour former
des tissus ou des organes.
• Chaque cellule contient environ 6 picogrammes (pg) d’ADN.

3
• L’extraction d’ADN génomique de référence s’effectue classiquement à partir de 5 mL de sang total recueilli sur
6
anticoagulant (EDTA) et correspondant à l’ADN leucocytaire : 20-50.10 leucocytes = 100-500 µg d’ADN. Le
mieux serait un ADN des gonades mais prélèvement trop douloureux.

1. Séparation des acides nucléiques

Si on utilise un tissu, on doit au préalable dissocier les cellules du tissu

1. Lyse des érythrocytes par une solution hypotonique

➔ il faut éliminer l’hémoglobine car elle est inhibitrice des réactions nécessaires à la suite de la manipulation.
Pas de questions sur les valeurs numériques.
• Les érythrocytes n’ont plus d’ADN donc ils ne nous intéressent pas, on lyse les érythrocytes par choc
hypotonique :
- Saccharose 320 mM.
- MgCl2 5mM.
- Tris 10 mM, pH 7,5 🡪 tampon (trihydroxyméthyaminométhane).
- Triton X100 1% 🡪 détergent (solubilise les graisses pour lyser les érythrocytes) = tensio-actif.
Centrifugation et lavage donnent un culot de leucocytes.

2. Lyse des leucocytes par choc hypotonique + protéinase K (dissocie les membranes par hydrolyse des
protéines)
• Libération des acides nucléiques + protéines+ lipides+…

3. Extraction de l’ADN par Phénol/chloroforme

Le chloroforme sert à solubiliser les lipides et l’ADN est dans le phéno

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 2. Quantification spectrophotométrique des acides nucléiques
• Mesure à 260nm : quantification des acides nucléiques (ADN, ARN).
• Mesure à 280nm : AA aromatiques donc quantification des protéines
• Lien entre absorbance est concentration via le coef d’absorbance linéique (epislon : M-1 /cm-1) 🡪 taille de la
cuve.
On effectue deux mesures une à 260nm et l’autre à 280nm :
🡪Information sur le degré de pureté de l’ADN : (mesure260/ mesure280)
Si rapport de 2, la solution est suffisamment pure.
Si le rapport est inférieur à 2 il y a trop de protéines et refaire une précipitation pour bien isoler l’ADN

• Quantification :
- Pour l’ADNds (double brin) 1 Abs = 50 µg/mL.
- Pour l’ADNss (simple brin) 1 Abs = 33 µg/mL.
- Pour l‘ARNss (simple brin) 1 Abs = 40 µg/mL.

3. Température de fusion des séquences d’acides nucléiques

On utilise la différence simple/ double brin pour calculer la Tm
• Tm (température de fusion) : T° à laquelle 50% de l’ADN est dénaturé c’est-à-dire sous
forme simple brin (le m dans Tm signifie melting) donc 50% sous forme double brin.

• Le Tm augmente avec :
- Le pourcentage de paires de bases GC.
- La concentration en sels (force ionique).
• Le Tm diminue avec les agents dénaturants (formamides, urée…)
• Effet Hyperchrome : différence simple/double brin caractériser par :
- Augmentation de l’absorbance à 260 nm (≈ 30% en moyenne), c’est-à-dire que l’ADN
simple brins va mieux absorber que l’ADN double brins.
- Dû à une perte de l’empilement des bases conduisant une meilleure excitabilité des
électrons des cycles aromatiques

• L’ADN double brin absorbe une certaine quantité de photons, qui augmente (de 30%) quand il passe simple brin :
c’est l’effet hyperchrome, dû à des modifications de l’empilement des bases (meilleure excitabilité des bases
azotées dans le simple brin).

4. Dénaturation et Hybridation des acides nucléiques (« renaturation de l’ADN »)

Techniques basées sur la dénaturation et l’hybridation :
- basé sur la chaleur : qui va rompre les liaison H entre les bases donc séparer les brins
- si on refroidit 🡪 réhybridation correcte donc maintien des solutions simple brins sur de la
glace

5. Structure des nucléotides utilisés en biologie moléculaire

• Nucléotide = association d’une base, d’un ose et de phosphate(s).
• ddNTP (didésoxy nucléoside triphosphate): Artificiel, créé pour les
techniques de biologie moléculaire pour le séquençage.
• Les NTP ne sont pas utilisé, ce sont les dNTP et les ddNTP en biologie
moléculaire

5
 6. Principe de la PCR
• PCR est l'abréviation de Polymerase Chain Reaction ou Réaction en Chaîne par Polymérase.
• L’objectif de la PCR :
- Amplification exponentielle d’une séquence d’ADN ou d’ARN à l’aide d’amorces qui vont délimiter la
séquence à amplifier.
- Permet d’obtenir des quantités importantes de matériel à partir d’un échantillon complexe et peu
abondant.

• Quantité d’ADN obtenues :

- Théoriquement 6 pg (≈ 5 fentomol)
- En pratique 20 ng (≈ 100 picomol)

6
Cinétique de la formation d’une séquence d’ADN au cours de la PCR :
Au cours du cycle on observe :
- 10 premiers cycles : on ne voit rien, quantité faible d’ADN
- phase exponentielle
- phase linéaire
- 30 cycles : phase de plateau, diminution du nombre de fragments
d’ADN produits et rendement qui devient nul

b) Action de l’ADN polymérase

• Il est aussi possible d’analyser les ARN par PCR… mais après transformations car les ARN sont des molécules
fragiles et instables.
• Classiquement ce sont les ARNm qui sont analysés. Les ARNm constituent 1 à 2% des ARN totaux.
• Techniques utilisant :
​ - une rétrotranscriptase (rétrovirus)
​ - une amorce
​ - les 4 dNTP
• La rétrotranscriptase possède une activité :
​ - de synthèse d’ADN 5’ 🡪 3’ à partir d’une matrice ARN
​ -RNase : destruction de la matrice ARN et synthèse d’un seul brin d’ADNc
​1 ARN m = 1 ADNc 🡪 quantification
• Dans un second temps utilisation d’une seconde amorce et d’ADN polymérase pour faire le second brin = ADNc
double brin stable

• Création de liaisons phosphodiester entre les carbones 3’ et 5’ de deux nucléotides adjacents si groupement
hydroxyle en 3’.
• Vitesse ≈ 1 000 nucléotides/minutes.

c) Visualisation des produits de PCR

• Séparation des séquences par électrophorèse en gel d’agarose (1,5%) en fonction de leur
taille. Les molécules migrent par un tampon dans de nombreux puits. L’intensité de la
bande donne une idée de la quantité d’ADN contenue dans la bande.

• Révélation des acides nucléiques grâce à des agents intercalants (produits fluorescents : Bromure
d’éthidium), se met entre les 2 brins d’ADN. 🡪Excitation UV : 300 nm.
🡪Émission : 360 nm.

d) La réaction de PCR de séquençage

• Identique à la PCR normal mais des fragments peuvent se finit par un ddNTP.
• ddNTP en quantité limitée : dans la majorité des cas c’est un dNTP qui entre, sinon si c’est un ddNTP il y a un
arrêt d’élongation (1 fois sur 100) 🡪 pas de liaison phosphodiester car il manque un hydroxyle.
• Réactifs : idem PCR + ddNTP marqués chacun par un fluorophore, fluorochrome différent et en quantité limitante
(environ 1%).

7
 e) Séquençage selon la méthode de Sanger
• 5’-ACTGCTAGCGATGAG…-3’ (séquence analysée), exemple de séquences nucléotidiques obtenues :
- ddT
- TddG
- TGddA
- TGAddC
- TGACddG
- TGACGddA
- TGACGA ddT
- TGACGATddC

• Produits de la PCR de séquençage analysé par électrophorèse capillaire en gel de polyacrylamide et détection
fluorométrique.
• A la fin de la PCR de séquençage, les produits de PCR ont toutes les tailles depuis amorce + 1 jusqu’à amorce + x
nucléotides et se terminent tous par un ddNMT marqué par un fluorochrome différent pour les 4 bases ATCG.
• Fin de la réaction : mélange de fragments de tailles différentes qui se finissent tous par un ddNTP.
• En sortie de colonne : détecteur de fluorescence (excite et récupère le photon émis) soit chromatogramme.
On peut ainsi établir la séquence.
Exemple :
Cytochrome P450 2C9 métabolise 15-20% des médicaments dont les sartans (anti- HTA), des AINS (ibuprofène),
le tamoxifène (anti-E2), des statines (hypocholestérolémiants) et pour lequel il existe des polymorphismes (SNP)
à l’origine d’une diminution de l’activité, donc médicaments plus efficaces mais aussi plus toxiques. Contribution
d’un polymorphisme à la détermination de la sensibilité à un facteur environnemental, le médicament.

Séquençage automatique de l’exon 4 du gène TP53 humain :

La hauteur correspond au nb de fragment et la couleur
correspond aux nucléotides particuliers.

Autre exemple :
Le codon 72 : exon 4 du gène TP53
Il code pour la protéine p53pour la régulation du cycle cellulaire 🡪 intéressant de connaitre la séquence notamment
pour les chimiothérapies cancéreuses.
- Forme sauvage : On observe l’enchainement CGC au séquençage, donc AA = arginine.
- Génotype hétérozygote pour le codon 72 : Arg ou Pro, CGC ou CCC
- Génotype homozygote pour le codon 72 : Pro donc CCC
En connaissant ce génotype on peut savoir quelle va être le type de réponse attendue à certaines chimiothérapies
anti-cancéreuses.

7. La RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

Technique de référence car peut mettre en évidence une mutation.
• Les bactéries ont développé des systèmes de protection conte l’intrusion de génomes étrangers, notamment
d’origine virale. Les séquences sur lesquelles agissent les enzymes de restriction sont toujours les mêmes.
• Ce sont des endonucléases soit des enzymes hydrolysant les acides nucléiques (liaisons phosphodiesters).
• Les endonucléases de restrictions :
- Reconnaissent une séquence de bases spécifiques portant sur 4 à 8 bases de l’ADN duplex étranger (viral).
- Hydrolysent une liaison phosphodiester sur chaque brin (soit en regard soit en décalé)
- Absence d’hydrolyse si modification du site de restriction (si il y a une mutation par exemple)
• Plus de 3 000 enzymes de restriction de type II ont été caractérisées, pour environ 200 séquences distinctes, les
choses sont donc limités. La plupart des enzymes de restriction reconnaissent des séquences palindromiques
(=séquence qui sur le brin sens et anti-sens sont les mêmes).
8
Restriction avec l’enzyme de restriction Eco (origine de E.Coli) R1 :
- Séquence palindromique (GAATTC), on coupe au niveau de l’Adénine, avec génération
d’extrémités cohésives (= qui n’ont pas la même longueur).
Si il y a une mutation dans la séquence palindromique, alors pas de coupure et on pourra donc
reconnaitre qu’il y a mutation.

Restriction avec l’enzyme de restriction Eco RV :

- Séquence palindromique avec coupe au milieu avec génération d’extrémités franches (quand l’enzyme coupe
au milieu).

Exemple d’application :
Analyse par PCR–RFLP du statut du codon 144 (exon 3) du gène Cyp2C9 humain :
Ce gène présente un polymorphisme dans le codon 144 (change une arginine en cystéine) et on effectue (après une
PCR standard donnant un fragment de 251 pb) une restriction par AVA II afin de déterminer de quel type de
polymorphisme le patient possède.
On met en place un site témoin de restriction qui sera systématiquement coupé pour prouver qu’une absence de
coupure correspond bien à une mutation et non un défaut de l’enzyme AVA II.

La zone de restriction est déterminée en fonction de la forme sauvage du gène et on devrait retrouver après
restriction deux fragments (dus à la coupure), un de 60pb et un de 169 pb.
-Pour la forme homozygote muté : pas de coupure donc 229pb
-Pour la forme hétérozygote : deux allèles avec trois fragment 169 ; 60 et 229pb.

Ensuite on observe les résultats grave à une électrophorèse sur gel d’agarose pour déterminer le type de
polymorphisme du patient. Ici on a 4 échantillons : 2 sauvages (pistes 1 et 3) et 2 hétérozygotes (pistes 2 et 4).

8. PCR extension d’amorce

Technique de référence (sensibilité et spécificité), compromis entre PCR de séquençage et standard.
On fait une PCR et on utilise des amorces qui s’arrêtent juste avant le nucléotide qu’on cherche à connaitre. On
utilise seulement des ddNTP, comme on connait la nature des bases on peut déterminer le polymorphisme
particulier pour un gène.

Les conditions sont identiques à celles de la PCR à l’exception :

- Du remplacement des dNTP par des ddNTP (que des ddNTP) marqués par des fluorochromes (compromis
entre la PCR standard et la PCR de séquençage), il y a donc l’intégration d’un seul nucléotide.
- De l’utilisation d’une seule amorce/SNP ou mutation recherchée.
- On ne peut pas chercher une mutation si on ne sait pas d’avance ou elle se trouve.
L’intérêt est qu’on peut travailler en multiplexe (=multiplexage) : on peut chercher plusieurs polymorphismes pour le
même patient. On met des amorces qui ont des tailles différentes avec 25 bases, le fragment après PCR aura donc 26

9
nucléotides et simultanément avec une amorce de 30nt pour un autre endroit. Utile en termes de rapidité et de
cout.
Cependant ici, seul un nucléotide va s’additionner donc il faut connaitre la position exacte de la mutation
recherchée, càd la position du nucléotide potentiellement altéré. L’amorce doit être positionnée de façon à ce que
l’extrémité 3’ se place sur le nucléotide précédent de celui dont on cherche à déterminer le type (A, T, C ou G). En
raison de la présence des seuls ddNTP marqués, un seul nucléotide sera intégré (amorce +1 et arrêt d’élongation).
Donc pas de recherche de mutation/ délétions / insertions ou de polymorphisme inconnu ou départ.
Par exemple dans l’étude des CYP qui permettent de métaboliser les médicaments, les différents polymorphismes
vont entrainer une activité plus ou moins importante de l’enzyme qui fera que le traitement chimio sera plus efficace
ou non (plus toxique ou non) : c’est la pharmaco-génétique. On a aussi des polymorphismes sur les transporteurs
BRCP et MDR1 qui ont un rôle dans le transport des médicaments.

Ici on vient de voir plusieurs techniques de référence qui sont utilisées quand on veut connaitre précisément quel
est le nucléotide modifié. On va voir ensuite des techniques qui ne sont pas des référence, développées pour
détecter des modifications de séquences sur des tailles plus importantes sans connaitre LE nucléotide modifié.

9. Single strand conformation polymorphism (SSCP) = Polymorphisme de conformation d’ADN

simple brin
Un fragment d’ADNds dans des conditions non-dénaturantes à une mobilité dans un gel, qui est fonction
essentiellement de sa longueur en pb et non de sa séquence.

Un fragment d’ADNss dans des conditions non-dénaturantes (= condition qui ne modifie pas les liaisons au sein d’un
même brin) adopte un reploiement 3D lié à des appariements intramoléculaires, et donc une conformation
dépendante de sa séquence. Donc la migration dépend cette fois-ci de la séquence.

Principe :
Wild = sauvage et heat = chaleur
On maintient les deux brins séparés dans des conditions non
dénaturantes puis prise de conformation en fonction de la
séquence.
On obtient deux brins différents qui n’auront pas la même
conformation donc deux bandes différentes lors de
l’électrophorèse pour chaque polymorphisme.

• Conditions pratiques de mise en évidence :

-Électrophorèse en gel d’acrylamide (% d’acrylamide)
-Conditions spécifiques : Température de migration, Conditions de dénaturation, Tampon de migration

• En moyenne, plus de 70% des cas de mutations ponctuelles aboutissent à un changement de conformation
détectable. (mauvaise détection des mutations de fin de série qui change mal la conf)
• La sensibilité est optimale pour des fragments jusqu'à 250 pb avec une seule condition (70-95%), et on a une
augmentation avec 2, 3 ou 4 conditions.
• Cette méthode est utilisée en première intention pour le criblage (rapide et peu onéreuse).

SSCP analysis of ITS1 regions amplified from different clinical Leishmania donovani isolates :
On veut savoir si il s’agit des memes variants sur différents échantillons.
10
Contrôle positif sur la ligne 1
On observe sur les pistes 4 et 5 le même variant, la piste 6 et 3 aussi et la piste 2 présente un troisième variant 

10. Formation et détection des hétéroduplexes

Lorsqu’on a une séquence avec mutation on peut la dissocier en simple brin puis les laisser se réassocier : ce qui
peut se passer est qu’ils peuvent s’associer correctement (homoduplexes) ou former des hétéroduplexes (= le A avec
le G).

• Tout ADN présentant une mutation ponctuelle (vs séquence de référence ou sauvage) est susceptible d’interagir
avec la séquence de référence par réassociation des brins complémentaires, en donnant 4 espèces différentes
d’ADNds :
- 2 homoduplexes parfaitement appariés (WT et Mt).
- 2 hétéroduplexes porteurs d’un mésappariement au niveau de la mutation.
• Il est possible de chercher l’existence ou non d’une mutation par la recherche de la présence d’hétéroduplexes ou
non en présence d’un ADN de référence :

• Plusieurs approches méthodologiques dont l’intérêt, une fois mises au point, est la rapidité et le faible coût,
permettant de cribler rapidement un grand nombre d’échantillons.
• Les échantillons positifs par ces approches :
✔ DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) : Au fur et à mesure que les éléments avance dans le gel la
concentration en agent dénaturant augmente 🡪 donc dissociation progressive. Les homoduplexes restent
plus longtemps attachés ce qui les différencient des hétéro.
✔ dHPLC : HPLC (chromato liquide haute performante) en conditions dénaturantes
• Sont ensuite confirmés par une méthode de référence (séquençage, extension d’amorce).

a) dHPLC : HPLC en conditions dénaturantes

Comme les autres ne pas connaitre trop dans le détail mais le
principe.
• Analyse des temps de rétention des hétéroduplexes et
homoduplexes sur colonne hydrophobe avec élution à
proportion croissante d’acétonitrile (agent dénaturant) à
température donnée (50-80°C).
• Après PCR, dénaturation (94°C) puis renaturation lente
(refroidissement à T° ambiante) avec formation des homo et
hétéroduplexes (+ /- wt).
• Dépôts des hétéroduplexes et homoduplexes sur la colonne (liaison ionique).
• Élution par un tampon chargé (-) et acétonitrile : les hétéroduplexes se détachent + tôt que les homoduplexes.
• Détection en sorte de colonne par spectrométrie à 260 nm ou par fluométrie (amorce marquée).

11. HRM (High Resolution Melting) et courbe de fusion

• L’objectif est de mettre en évidence une différence de dénaturation des 2 brins d’ADN liée à une différence de
séquence (mutation, polymorphisme…). PCR quantitative (QPCR) : on cherche la quantité d’ADN, HRM permet
également une approche qualitative.
• La PCR est suivie d’une courbe de fusion en présence de fluorophore intercalant. Produit de PCR à 40°C : double
brin permettant le positionnement de fluorophore (fluorescence maximum).
• La fluorescence est proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié. On a une augmentation lente de la température
(0,1°C/s) : déshybridation progressive des 2 brins et libération du fluorophore puis diminution progressive de la
fluorescence selon un mode sigmoïdal. On inclue des témoins positif (homozygote, hétérozygote, sauvage) pour
avoir une information plus précise.

11
• Cette déshybridation est fonction de la séquence en nucléotides : + rapide sur les hétéroduplexes que
homoduplexes donc on retrouve encore plusieurs pics.
- Intérêt pour le criblage de grandes séries
- Confirmation par une méthode de référence (séquençage, primer extension) car possibilité de faux
positifs (sensibilité) et de faux négatifs (spécificité).
• Cette technique débute donc par une PCR quantitative (pour déterminer le nombre de séquence) puis
augmentation progressive de la T° à partir de 40°C et mesure de la fluorescence en continue → courbe de fusion.
La mesure par les appareils ne commence que quand on a la réassociation en double brin.

• Les méthodes SSCP, dHPLC, DGGE, HRM (non de référence) :

- Peuvent être parfois un peu longues à mettre au point
- Mais permettent un criblage rapide.
- Méthodes de choix pour analyser un grand nombre d’échantillons.
• En revanche, pas de sensibilité de 100% (il existe des faux négatif). Ce ne sont pas des méthodes de référence.

IV. Applications

• Certains traitements sont inefficaces en cas de présence de certaines mutations. On recherche une mutation
chez un patient pour estimer s’il l’a potentiellement transmise à ses enfants, ou si ses frères et sœurs peuvent
porter la mutation.
• Cancérologie : identification de mutations géniques donnant des informations pronostiques (biopsie) ou de
réponse à certains traitements.
• Génétique constitutionnelle : identification de mutations chez les parents et recherche dans la descendance
(CFTR (mucoviscidose), p53…).
• Pharmacogénétique : identification de polymorphismes déterminant la réponse à certains traitements
(anticancéreux, anticoagulant, anti-inflammatoires…). Pour les patient variants homozygote du CYP du C9, ils ont
de gros risques hémorragiques avec une posologie normale d’anti-coagulants.

1. Caractérisation moléculaire des cancers

• P53 est un suppresseur de tumeurs impliqué dans le contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose, l’angiogenèse, la
dissémination… Il est très fréquemment muté lors de cancer.

2. Intérêts de la détermination du statut de P53 dans les tumeurs

• Pronostic péjoratif pour celles exprimant une forme mutée de P53.
• Réponse au traitement : diminution de l’induction d’apoptose par les thérapies conventionnelles, donc
diminution de la sensibilité aux traitements, c’est la p53 qui induit la mort en réponse au traitement donc si elle
est mutée c’est pas cool 🡪 modif du traitement à apporter.

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• Le hot spot (certains codons impliqués dans le domaine de liaison à l’ADN)
est le point le plus souvent muté, mais Le profil est très large est nécessite
plusieurs PCR. Les mutations sur ce gène restent très variables. Les courbes
de survie sont bcp plus faible si la mutation porte sur le codon 175.
• On retrouve des mutations : non-sens, silencieuse, sur site d’épissage,
décalage du cadre de lecture (insertions et délétions), et la grande majorité
sont des faux-sens.
• Dans un certain contexte (âge < 45ans), possibilité de formes familiales
(syndrome de Li-Fraumeni 🡪 un allèle sauvage et un allèle muté de p53)
donc + de cancers (surtout cancers du sein) : intérêt dans la mise en place de mesures préventives chez les
descendants et collatéraux. La fréquence de mutation de p53 démontre son rôle important.

Recherche d’une mutation sur l’exon 7 (codon 249) du gène p53 par PCR-RFLP :
Mise en évidence d’un fragment non coupé car perte du site de restriction alors
que les autres sont normaux
Il n’y a pas de mutation sur le codon 249

Recherche d’une mutation sur l’exon 8 du gène p53 par SSCP :

On voit une modification de la migration dans le gène en fonction de la
forme de l’ADN (double brin, simple brin ou muté).
Les séquences se séparent en fonction de leur taille.
En simple brin, nous avons un profil différent entre l’ADN sauvage et l’ADN muté.
Ce n’est pas le cas de l’ADN double brin.
On sait qu’il y a une mutation du l’exon 8 mais on ne sait pas laquelle.
Il faut donc séquencer ensuite.

Recherche d’une mutation sur l’exon 5 du gène p53 par DGGE :

Mise en évidence d’une forme sauvage et muté 🡪 on a donc ici une mutation sur
l’exon 5.

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