M1 BGV

Génomique structurale
et protéomique
6éme cours..
 Rappels
• Pour étudier les gènes (et leurs fonctions), il faut préalablement en connaître
leur séquence , c'est à dire, "le texte" (la chaîne de nucléotides) qui la compose.
L'acquisition de celle-ci se fait grâce à la technique du séquençage . Toutefois,
celle-ci n'autorise la lecture que de séquences relativements courtes (plusieurs
centaines de paires de bases). Le génome, en raison de sa taille, doit donc être
fractionné pour être "décrypté" (lu), étudié et analysé. Pour accéder aux
séquences du génome, plusieurs étapes sont ainsi rendues nécessaires.

1.Découpage du génome et construction d'une banque de clones

(chaque clone correspondant à un fragment du génome) voir cours n°5 ; Td
N°1 :Clonage dans un plasmide et la suite dans le cours N°6

2. Etablissement de la carte physique du génome (Ordonnancement de fragments

clonés chevauchants)

3. Séquencage de chacun des fragments

4. Etablissement de la carte génétique (Ordonnancement de marqueurs génétiques

sur les chromosomes)
Nous verrons les trois dernières étapes dans les cours qui vont suivre
1.3 Stratégies de fragmentation (suite du cours n°5)

LES vecteurs COSMIDES

 Ce sont des vecteurs non sauvages (synthétiques ou artificiels). Fabriqués à partir de la
combinaison de plasmides (donc possibilité de réplication) et de séquences cos du phage
lambda (possibilité de pénétration à l’intérieur des bactéries)

hybrides entre les plasmides et le bactériophage .

• Ils possèdent venant de plasmides: leur origine de réplication et un gène conférant un
résistance à un antibiotique

• et venant de phage lambda les extrémités cos et donc l'aptitude à être emballés
automatiquement dans un mélange de têtes et queues de phage lambda .
 les cosmides permettent d’intégrer des fragments d’ADN plus long (environ 45 Kb).

Cosmide: site cos du phage λ + plasmide

→ Clonage de fragment de 45 kb maximum (capacité λ ×3)
Sites cos λ → Encapsidation in vitro
→ Particules virales capables d'infecter E. coli
Origine de réplication plasmidique
→ Multiplication dans la bactérie de la même façon qu'un plasmide
1.3 Stratégies de fragmentation (suite du cours n°5)
LES vecteurs COSMIDES

Site multicolonnage
ou polylinker

Schéma d'un cosmide

Mode d'emploi d'un cosmide pour la
constitution d'une banque.

• L’utilisation du cosmide passe

par son ouverture par une
enzyme de restriction puis une
attaque des extrémités par une
phosphatase.
• L’ADN à insérer (de 35 à 45
Kb) est ajouté au cosmide;
• puis l’hybride (Les cosmides),
après assemblage in vitro
(empaqueté) dans les têtes de
phages qui vont se fixer sur la
paroi de la cellule hôte et
injecter leur ADN. Celui-ci
grâce aux extrémités cos se
circularise et se réplique
comme un plasmide mais
aucune des fonctions
phagiques ne peut être
exprimée donc les cellules
survivent et forment des
clones.
 1.Les cosmides (ci-contre) sont des plasmides dans lesquels a été
Récapitulatif L’utilisation du cosmide
inséré le site cos (carré noir) du phage lambda.
• Le site cos rend possible l'empaquetage (in vitro) du plasmide
(porteur d'un insert) dans la tête du phage lambda.
• 2.Les cosmides sont coupés en un site de restriction unique par
l'action d'une endonucléase.
• 3.On mélange alors les molécules linéarisées avec les fragments
d'ADN constituant l'insert (lignes pointillées) coupés avec la même
enzyme.
• 4.Cosmides et fragments s'unissent au hassard et, dans certains
cas, un fragment sera flanqué de deux cosmides (au centre).
• Si, dans une telle molécule, la distance de cos à cos est d'environ 40
à 50 kb, alors, la séquence cos-cos a la bonne taille pour être
empaquetée dans la tête du phage lambda.
• 5.Un clivage enzymatique aux sites cos (têtes de flèche) crée des
bouts collants et, en présence des composants du phage,
l'empaquetage des molécules recombinantes s'effectue.
• 6.Après addition de la queue, la particule peut injecter son ADN
recombinant dans une bactérie (exactement comme un phage
lambda ordinaire). L'ADN injecté se circularise, via les sites cos, et
se réplique comme un plasmide. On peut détecter sa présence dans
la cellule, par l'expression de gènes de résistance à des
antibiotiques, codés par le plasmide.
La recherche de séquences spécifiques s'effectue par les mêmes
moyens que ceux utilisés avec les vecteurs plasmidiques voir Td
N°1).
  Les vecteurs BACs
Construction de banques d'ADN génomique de grands fragments (BAC)

• les banques de grands fragments d'ADN génomique (ou banques BAC)

sont essentielles à l’étude des génomes.
• Le clonage des fragments d'ADN de grande taille (maximum de 300 kb)
dans des vecteurs BAC facilite leur manipulation et leur multiplication
ainsi que leur conservation à long terme.
• Une banque BAC peut être utilisée pour identifier et isoler des gènes
d'intérêt ou pour définir et séquencer un génome, la cartographie physique
.
• le BAC, ce Chromosome artificiel bactérien est une construction d’ADN
fondée sur un plasmide isolé à partir de E. coli. ( cad un vecteur
artificiel ADN basé sur plasmide F (VOIR COURS PRECEDENT)
  Les vecteurs BACs
Construction de banques d'ADN génomique de grands fragments (BAC)

les étapes de construction des banques BAC

Extraction d’ADN à partir d’un tissu végétal jusqu’à la

production de clones BAC réarrangés en microplaques :
• Extraction de noyaux à partir de tissu de la plante
d’intérêt afin de disposer d’ADN de haut poids
moléculaire
• Digestion partielle de l’ADN de haut poids
moléculaire
• Sélection des fragments d'ADN de 100 à 250 kb
• Ligation dans un vecteur de clonage
• Clonage dans une bactérie E. coli résistante au phage
• Organisation des clones BAC en microplaques en
utilisant une station robotique à haut débit
• Contrôle qualité et caractérisation de la bibliothèque
•Le chromosome artificiel Récapitulatif : Le chromosome artificiel bactérien
bactérien (BAC) est un (BAC)

chromosome construit
artificiellement pour le clonage
moléculaire.
•Il a des régions spécifiques de
E. coli F plasmide (l'origine de
réplication est issue de
l'épisome sexuel F de E. coli) et
il est circulaire et super enroulé.
•BAC est développé pour cloner
des fragments d'ADN dans des
bactéries, E. coli .

•Il peut contenir des fragments d'ADN ayant des tailles allant
jusqu'à 300 kb.
Les vecteurs YACs
• YAC (chromosome artificiel de levure) est un chromosome construit artificiellement qui
a la capacité de transporter un grand segment d'ADN étranger et de se répliquer dans les
cellules de levure. Il possède tous les éléments nécessaires pour maintenir un
chromosome eucaryote dans le noyau de la levure
un centromère, nécessaires à la stabilité
mitotique
des télomères artificielles pour convertir
le plasmide circulaire en un morceau
.
linéaire d'ADN
des séquences de réplication
autonome qui sont essentielles à la
réplication de la levure et à la stabilité.
un marqueur sélectif ou des marqueurs
 des sites de restriction (polylinker)

pour en faire un vecteur de

clonage efficace

Une grande séquence allant de 1000 kb à 2000 kb peut être insérée dans YAC et
transférée dans la levure.
Nb: L'efficacité de la transformation de YAC est très faible.
Les vecteurs YACs
• Ils peuvent véhiculer de grands gènes eucaryotes, avec promoteur(s) et séquences de contrôle, et conviennent
donc pour étudier les fonctions des gènes.
• On a utilisé les Yacs pour la cartographie du génome humain.

Construction vecteurs YACs

YAC est construit en utilisant un ADN circulaire initial plasmide , qui est généralement
découpé en une molécule d'ADN linéaire en utilisant des enzymes de restriction ;
ligases d'ADN est ensuite utilisé pour ligaturer une séquence d'ADN ou gène d'intérêt dans
l'ADN linéarisé, en formant un seul grand fragment d'ADN circulaire.

Voir diapo suivante …

1. clivage avec une endonucléase de restriction
(ici BamH I) permet d'éliminer une longueur
d'ADN entre deux séquences de télomères,
laissant les télomères aux extrémités de l'ADN
linéarisé.

2.Le clivage à un autre site interne

(EcoRI) divise le vecteur en deux
segments d'ADN, appelés bras du
vecteur, chacun avec un marqueur
sélectionnable différent (X, Y)

3.L'ADN génomique à cloner est préparé

par digestion partielle avec des
endonucléases de restriction (EcoRI) pour
obtenir un fragment de taille appropriée

4. Transformation de la levure et
sélection des colonies recombinantes
1.3 Stratégies de fragmentation (suite du cours n°5)

• À partir d’un génome donné, ces vecteurs

permettent de réaliser des banques d’ADN
pratiquement exhaustives, en utilisant un
nombre de clones beaucoup plus raisonnable que
les plasmides destinés au séquençage. Ainsi, le
Centre d’étude du polymorphisme humain ont
réalisé une banque du génome humain composée
de 33 000 YACs avec des fragments insérés dont
la longueur moyenne était de l’ordre de 1 Mpb.
 Les banques de clones de grande taille ne sont pas directement exploitables
pour la séquence. L’idée est donc de construire une carte positionnant les
YACs, BACs ou cosmides les uns par rapports aux autres, sur les
chromosomes composant le génome étudié.

Cette carte présente

deux avantages :
Elle peut servir de cadre
pour un programme de
séquençage. Une fois les
YACs positionnés, il
suffit de les séquencer de
manière ordonnée, en
utilisant la stratégie
aléatoire ( fig 6) Figure 6: Stratégie de séquençage en deux étapes avec
cartographie intermédiaire
1.4 Assemblage de séquence

• La méthode d’assemblage des

fragments séquencés requiert dans un
premier temps l’identification des
chevauchements possibles. Un contig est une séquence
génomique continue et ordonnée
générée par l'assemblage des clones
• Il s’agit de repérer les clones d'une bibliothèque génomique (sous
partageant des séquences communes. forme de plasmides, cosmides, BAC
ou YAC) qui se chevauchent.
Si deux clones se recouvrent, on les
réunit pour former ce que l’on appelle
un contig, terme qui est devenu
consacré pour définir un ensemble de
fragments qui sont reliés entre eux par
des recouvrements de séquences
identiques (ou très similaires)
Représentation graphique de la construction d'un contig

Ces opérations sont effectuées par des programmes

bioinformatiques
 Récapitulatif
• L'étude de génomes entiers est un domaine relativement nouveau qui
promet de dévoiler de nombreux secrets de la biologie.
• Il s'agit notamment de l'identification des gènes responsables de maladies,
de la génération d'arbres d'évolution plus précis et de la compréhension
de la manière dont la cellule réagit aux changements de son
environnement au niveau moléculaire.
• Tous ces travaux sont basés sur la capacité à aligner et à séquencer de très
grands morceaux d'ADN pour créer une carte complète de chaque
chromosome présent dans un organisme.
• Pour générer une carte complète, les premiers clones individuels qui se
chevauchent sont disposés de manière à produire des régions contiguës
d'un chromosome (appelé contig).
• En faisant se chevaucher plusieurs clones de 50 à 250 000 bases, nous
pouvons générer des contiguës qui couvrent des millions de bases sur un
chromosome.
• Comme ces clones contiennent une telle quantité d'ADN génomique, ils ne
peuvent pas être transportés sur des plasmides traditionnels, mais sont
plutôt clonés dans des chromosomes artificiels spéciaux. Il peut s'agir de
chromosomes artificiels bactériens (BAC), de chromosomes artificiels de
 Schéma bilan

trous ("gap"): parties

non assemblées :