Génie Génétique K2

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Chap 2 : Clonage
Objectifs :
- Comprendre certaines applications des technologies de l’ADN recombinant
- Avoir une vue d’ensemble des étapes impliquées dans une stratégie de clonage de base

I. Principe général du clonage

3 éléments :
- L’ADN à cloner
- Le vecteur du segment d’ADN cloné
- La cellule hôte

Fragment d’ADN ADN – vecteur

Obtention du fragment d’ADN d’intérêt = « transporteur » d’ADN
- Coupure et extraction à partir d’un autre
plasmide Insertion du fragment d’intérêt dans le vecteur
- Criblage de banques d’ADN
- Par PCR
- Par synthèse chimique

II. Propriétés générales des ADN – Vecteurs

1) Définition et rôle
- Rôle de transporteur du morceau d’ADN à cloner
- Permet le maintien de l’ADN dans la cellule hôte
- Permet la sélection des cellules recombinantes
- Permet la réplication autonome
- Présentent des séquences caractéristiques reconnus par :
o Des protéines et enzymes procaryotes : vecteurs procaryotes
o Des protéines et enzymes eucaryotes : vecteurs eucaryotes
o Les deux : vecteurs navettes

2) Les différents types de vecteurs

a) Vecteurs de clonage

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Destinés à l’isolement d’un fragment d’ADN, appelé « insert » et à l’amplifier dans une cellule hôte

- Origine de réplication donnant une

réplication autonome
- Marqueur de sélection
- Possède une région « polylinker » ou site de
clonage multiple (MCS)
- Petite taille
- Facilement introduit dans les cellules-hôte
- Stabilité

b) Vecteurs d’expression
Dérivent des vecteurs de clonage
Destinés à isoler une séquence codante (gène) pour l’introduire dans une cellule-hôte appropriée afin de l’exprimer

- Les mêmes caractéristiques que celles des vecteurs de

clonage (la réplication n’est cependant pas toujours
épisomique pour les vecteurs eucaryotes)
- Présence d’un promoteur (régulé)
- Un site de terminaison de la transcription
- Site de liaison pour le ribosome (RBS si procaryote)
- Un codon STOP (présent sur le vecteur ou l’insert)

3) Différents vecteurs de clonage

a) Les plasmides bactéries à l’état naturel :

- Nombreux plasmides à l’état naturel
- Réplication autonome grâce à Ori
- Taille élevée (90 Kb pour plasmide R1)
- Résistance aux antibiotiques souvent portée par des transposons (Tn3 pour plasmide R1)
- Nombre de copies variables suivant des plasmides
o 2 copies pour R1
o 15 à 30 copies pour CoIE1

 Les plasmides utilisés comme vecteurs en GG sont des hybrides et ont été modifiés par rapport aux originaux

b) Les plasmides de synthèse : Cf. V – 3) cour de Zeniou (Z1)

- Sites de restriction uniques à l’intérieur des gènes de résistances aux antibiotiques
- Modification de l’origine de réplication permettant la régulation du nombre de copies dans la bactérie
- Taille réduite → permettent d’insérer jusqu’à 9Kb d’ADN

Plasmide pBR322 = plasmide de 1ère génération :

Origine de réplication
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- Constitué de 3 parties :
o Tn3 → AmpR : synthèse d’une enzyme hydrolysant le cycle β-lactame : résistance à l’ampicilline = bla
o Col E1 : on n’a pris que la région portant l’Ori (origine de réplication)
o R6 → tetR : empêche l’entrée de l’antibiotique = résistance à la tétracycline
- Carte de restriction de pBR322 :
o Sites de restrictions uniques : EcoR1, BamH1
o Origine pMB9 (= ColE1)

Plasmides de 2ndegénération Insertion gène dans

polylinker → coupe lac z en
Ex : Vecteurs pUC (2,7 Kb) : 2 : pas exprimé
Si gène ne s’est pas inséré :
Sélection des bactéries contenant -galactosidase exprimée →
le vecteur recombinant par leur clive substrat en 2 : devient
couleur en présence substrat bleu
galactosidase (blanches – bactéries
sans plasmide bleues).
Poly linker

Type d’origine de réplication

(ColE1, pMB9, Ori pUc) →
détermine nb de copies du
plasmide dans bactéries

Gène de résistance
à l’ampicilline

 Contient tous les éléments pour expression d’une protéine mais n’est pas un vecteur d’expression typique → sert au
clonage

Site de clonage multiple dans pUC : polylinker, polycloning site

Insertion d’un linker au début du gène lacZ’ :

c) Vecteurs d’expression

Eléments sur un vecteur d’expression procaryote simple :

Prokaryoytic expression vector :

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P-(o)- AGGAGG – N8 – ATG// gène d’intérêt – STOP

SD = RBS

Exemple des vecteurs pET :

Structure générale

- Opérateur opéron lactose

- Linker = MCS (site de clonage multiple)
- Promoteur du phage T7 auquel on associe l’opérateur de l’opéron lactose (endroit où se fixe le répresseur)
- Répresseur Lac (LacI)
- Origine phage monobrin f1
Les flèches indiquent les sens de transcription. Il y a des sens de transcription opposés
Si on met ce plasmide dans une bactérie, on aura entre 15 et 20 copies.

 Donc :
o pUC→ vecteurs de clonage : Ori modifiée → environ 300 copies de gènes
o pET → vecteurs d’expression : Ori ColE1 → 15 – 20 copies par cellule / plasmide

d) Phages
Phage = assemblage supramoléculaire constitué de protéines

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ADN db linéaire
environ 48Kb
avec exé cos

2 intérêts essentiels par rapport aux plasmides :

- ils peuvent véhiculer des morceaux d’ADN plus longs : taille de l’insert comprise entre 12 et 22 kb
- Infection spontanée des cellules bactériennes : ils ne pénètrent pas en entier il n’y a que leur génome qui entre
dans la bactérie

Cycle phagique :

Injection ADN linéaire db

dans bactérie → extés
Réplication
COS sb riches en G et C →
circularisation

- Cycle lytique : infection d’une cellule bactérienne et multiplication tellement importante que la bactérie éclate :
o Injection de l’ADN
o Après injection il faut que l’ADN se circularise
o Réplication de l’ADN phagique
o Synthèse de protéines virales (ex : protéine de la tête, de la queue du phage)
o Mélange de génome et de protéine : auto-assemblage des particules virales (formation de nouveaux
phages
o Lyse cellulaire et libération des nouveaux phages
ou
- Lysogénie : ADN phagique entre dans la bactérie, est intégré dans le chromosome bactérien et peut rester
silencieux :
o Infection de la bactérie par le phage
o Injection de l’ADN phagique
o L’ADN phagique va être intégré au génome de la bactérie par une étape de recombinaison
o Cette recombinaison est réversible si on stress la molécule (UV, …)
o Le phage ressort du génome et on peut repartir dans un cycle lytique avec expression des protéines
virales, assemblages pour former des nouveaux phages et éclatement de la bactérie
Rq : La lysogénie ne repart pas forcément dans un cycle lytique.
Rq : n’importe quel phage n’infecte pas n’importe quelle bactérie.

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e) Vecteurs dérivés du bactériophage λ :

- Le plus utilisé : Phage λ : ADN double brin
- Les gènes non essentiels peuvent être éliminés et remplacés par de l’ADN étranger
- Les vecteurs dérivés de λ utilisés pour le clonage ont des sites de restriction de part et d’autre de la partie qui
peut être éliminée

Deux stratégies d’utilisation de vecteurs λ :

(au total la taille doit être proche de 48 Kb)
- Stratégie par délétion / remplacement (environ 16 – 26 Kb)

On garde le bras droit et le bras gauche et on enlève la partie centrale et on la remplace par l’ADN qu’on souhaite insérer et
on s’en sert comme vecteur
- Stratégie par insertion (environ 0 – 12 Kb)

On coupe au site de restriction Eco RI, il reste les bras droit et gauche, on insère l’ADN souhaité.
Les extrémités cos sont importantes pour pouvoir circulariser car elles sont complémentaire et donc s’assemblent.

f) Les cosmides Autres types de vecteur : pour

cloner des fragments de + en
Définition : + grands

= Vecteur artificiel constitué d’un plasmide auquel ont été rajoutées les extrémités COS du phage , qui sont des extrémités
cohésives permettant l’encapsidation, du bactériophage λ.
Possède les avantages du plasmide d’une part et du phage λ d’autre part :
- Gènes de résistance et origine de réplication du plasmide
- Capacité à s’encapsider du phage λ

Intérêt
Permet le clonage de fragment d’ADN allant jusqu’à 45 Kb

g) Les BAC (BacterialArtificial Chromosomes)

- Ils dérivent d’un plasmide : le facteur F
- Servent à cloner de grands fragments d’ADN (300 Kb)
- Présents en une seule copie dans la bactérie hôte

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h) Chromosomes artificiels de levure ou YAC (YeastArtificial Chromosomes)

Définition
- vecteurs pour cellules eucaryotes (levures)
- Construits en utilisant les séquences constituant l’origine de réplication, le centromère et les télomères d’un
chromosome de levure de manière à être répliqués et conservés dans les levures au cours des divisions
cellulaires.
- Permet de véhiculer de l’ADN de 100 à 2000 Kb

i) Chromosomes artificiels de mammifères ou MACs( MammilianArtificial Chromosomes)

Structure comparable aux YACs en mettant des centromères et des télomères dérivés des chromosomes de mammifères

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III. Techniques d’insertion d’ADN dans un plasmide

Principe général :

Segment d’ADN d’intérêt = l’insert + un plasmide = plasmide recombiné.

Principales techniques de production d’un plasmide recombiné :

- utilisation d’enzymes de restriction
- méthode Topo TA (non traitée)
- utilisation de recombinases
- technique LIC (clonage indépendant de la ligase)
- technique EFC (clonage enzyme-indépendant).

1) Utilisation d’enzymes de restriction

Exemple de clonage utilisant le vecteur pBR322 :

AmpR + Eco R1 + TetR + Bam H1 : résistance à la tétracycline. Segment
d’intérêt linéaire avec extrémités BamH1 + AmpR + TetR : hybridation +
ligase
On obtient en réalité 2 produits : pBBR322 refermé sur lui-même +
pBR322 hybride avec l’insert.
On les met dans les bactéries, on obtient 3 sortes différentes :
- une bactérie avec un chromosome bactérien : non
résistante
- une bactérie avec le plasmide recombiné : résistance à
l’ampicilline
- une bactérie avec le plasmide non recombiné : résistance
aux 2

L’utilisation d’une seule enzyme de restriction permet l’insertion du

fragment d’ADN dans 2 sens. Le clonage est dit « non directionnel ».
Coupure enzymatique du vecteur + insertion du fragment d’ADN à
cloner coupé par BamH1

Le clonage « directionnel » est obtenu en utilisant deux

enzymes de restriction. D’où l’intérêt des sites de clonage
multiples sur les vecteurs.

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2) Clonage par recombinases

a) Recombinaison site spécifique : attP x attB

Recombinaison entre 2 ADN à un endroit précis.
B : bactérie
Ex : intégration du phage lambda dans E. coli
P : phage
Att = site d’attachement
Coupure au niveau attP et attB puis recombinaison.
Recombinaison entre 2 parties qui ont le même nombre de
séquences. La zone centrale d’attB va se mettre dans la partie
centrale d’attP → régions qui apparaissent par recombinaison
s’appellent attL et attR (pour right et left).

La recombinaison se fait à un endroit spécifique, et fait intervenir

l’intégrase (phage) et le facteur IHF (hôte). L’ensemble de cette
intégrase et du facteur forme une recombinase qui fera
l’intégration.

Mise en jeu des homologies d’ADN (O) : séquence de 15-mers

identiques sur le génome bactérien et du phage, contenue dans les sites d’attachement appelés attP et attB.

Excision : sortie du phage du génome bactérien. Fait intervenir l’intégrase et l’excisionase (Xis), codées par le phage, et IHF
codée par E. coli.
attL et attR sont des séquences répétées directes.

b) Utilisation des recombinases en génie génétique

Permet d’insérer un fragment d’ADN dans un plasmide : nombre de sites d’attachement
sur le plasmide pas limité à un seul.

Un élément central peut être encadré par des sites att. Cet encadrement permet de
déplacer un gène sur un autre plasmide.
→ Faire rapidement des échanges de morceaux d’ADN entre des plasmides différents.
attP1 ne peut se recombiner qu’avec attB1 et idem pour attP2 et attB2 : dans le but de
n’obtenir que le résultat attendu.

c) Le système de clonage Gateway®

Principe
Technique universelle de clonage, basée sur :
- la recombinaison des sites att (B, P, L, R)
- mélange d’enzymes appelé Clonase® contenant une intégrase Int, un facteur d’intégration IHF et dans certains
cas une excisionase Xis.
Gateway® permet l’insertion rapide de séquences d’ADN dans de multiples vecteurs.

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Génération par PCR gène

d’intérêt, ajout seq attB
Vecteur : seq attP
Clonase BP → obtention
clone (avec extés attL) +
produits gène-extés attR
2 vecteurs avec des extés
L pour 1 et R pour l’autre
→ ajout clonase LR →
clone d’expression avec
attB + produit avec attP

On va créer le clone d’entrée, d’où on pourra aller sur toute une série de vecteurs (d’expression, etc.).
On est toujours obligé de repasser par le clone d’entrée pour passer d’un élément à l’autre.

d) Le clonage par la recombinaison Cre-lox

= recombinaison site spécifique du bactériophage P1 (E. coli).

Principe de la recombinaison Cre lox

Cre = recombinase du phage P1 qui reconnait les sites Lox.
Site Lox : séquence d’ADN de 34 pb comprenant 13 nucléotides palindromiques aux extrémités.

Schéma de recombinaison entres sites lox ayant la même orientation :

On ajoute Cre et recombinaison : si on enlève le gène cible, il ne reste que la partie lox. Conservatif : tout est récupéré. Un site
Lox est sur la partie du gène cible, l’autre sur l’ADN.

Le système Creator (Clontech)

Utilise l’enzyme Cre et les sites lox.
Permet de sous-cloner un gène porté par un vecteur donneur dans un vecteur accepteur pour former

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un clone d’expression.

3) Technique de clonage LIC = ligase independant cloning

Technique de clonage basée sur :
- l’utilisation des propriétés exonucléasiques 3’-5’ des ADN polymérases fidèles (T4 pol)
- la production et l’utilisation d’extrémités simple brin longue et complémentaire sur l’insert et le vecteur.
- l’utilisation de l’hybride insert/vecteur pour la transformation bactérienne sans l’intervention d’une ligase
exogène.

Production d’un insert avec des extrémités LIC complémentaires de celles présentes sur le plasmide :
Sur les séquences débordantes de l’insert et du vecteur, il n’y a que 3 nucléotides sur les 4 existantes.

Principe pour la production de l’insert :

Amorces s’hybrident sur le gène cible, on rajoute LIC dans un premier
temps qui ne s’hybride pas.
Par PCR on obtient le gène cible sur l’ADN double brin. On ne peut pas
utiliser ce produit pour faire un clonage LIC puisqu’il faut un simple
brin. On utilise donc l’enzyme T4 pol et un seul désoxyribonucléotide
dATP avec les propriétés 5’-3’ pol et 3’-5’ exo.
On obtient l’insert sur simple brin. Pas d’A entre 5’ et le T.

Technique développée par la société Novagen : séries de vecteurs de

la famille pET-LIC

- L’hybride plasmide/insert est utilisé tel quel sans

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l’intervention de ligase in vitro.

- Les liaisons phosphodiesters sont mises en place par la ligase bactérienne endogène de la bactérie E.coli

Avantages :
- évite l’utilisation des enzymes de restriction
- clonage directionnel
- compatible avec du clonage à haut débit.

4) La technique EFC = enzyme free cloning

Amélioration de la technique LIC : ne nécessite qu’une seule enzyme.
Basée sur la PCR asymétrique (hetero-stagger PCR) afin de créer des extrémités débordantes longues simples brins
différentes aux deux extrémités des brins du gène cible et éventuellement du vecteur.

On fait une première PCR avec l’amorce 5’ qui sera plus longue, et l’amorce 3’ qui aura la longueur du fragment bleu = PCR A.
Amorce 5’ qui a exactement la longueur du fragment rouge, amorce 3’ qui est un peu plus longue = PCR B.

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Purification, mélange des produits issus des 2 PCR, dénaturation par la température.
Puis réhybridation à température ambiante.

Exemple : insertion dans un vecteur pET

Complémentarité insert/vecteur :

Extrémités 5’ simple brin débordantes ou extrémités 3’ simple brin débordantes.

Remarque : le plasmide peut aussi être généré par PCR asymétrique.

Avantages :
Adaptée au clonage à haut débit
Préparation aisée d’une grande quantité de vecteurs
Pas de problèmes liés à l’activité de l’ADN polymérase T4
Extrémités débordantes avec les 4 nucléotides
Libre choix des séquences des extrémités
Inconvénients :
Nécessité d’avoir une ADN pol qui permet la synthèse de
longs fragments d’ADN avec une grande fidélité (plus un
pb à l’heure actuelle)

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5) Conclusion
L’amélioration des techniques de clonage tend à réduire les besoins en matériel enzymatique :
- la technique LIC évite l’utilisation d’enzymes de restriction et de ligases exogènes
- la technique EFC permet de palier les limites de l’utilisation de l’ADN polymérase T4 en passant par la PCR
asymétrique.

IV. Les sources d’ADN pour le clonage

Obtention de l’ADN :
- à partir de banques d’ADN : banque d’ADN génomique, banque d’ADN complémentaire
- par PCR
- par synthèse chimique d’oligonucléotides suivie d’un assemblage
- par sous-clonage

1) Les banques d’ADN

Les différents types de banques
- les banques d’ADN génomique
- les banques d’ADN complémentaire

a) Banque d’ADN génomique

Contient sous forme morcelée, l’ensemble de l’ADN
génomique d’un organisme donné.
Insertion dans plasmides, phages ou cosmides.

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b) Banque d’ADNc
Constituée de l’ensemble des ADNc d’une cellule ou d’un type cellulaire donné
Elle est spécifique d’un tissu.
Construction d’une banque d’ADNc :

2) PCR
Une des méthodes les plus employées, soit à partir d’ADN génomique, soit à partir d’ADN complémentaire, soit à partir d’un
fragment d’ADN déjà cloné.

A partir d’ADN génomique

L’ADN génomique comporte la séquence totale du génome et donc l’ensemble des gènes de l’espèce.
Les gènes comprennent les exons (séquences codantes) et les introns (séquences non codantes).
L’amplification peut cibler (selon les amorces choisies) :
- la partie codante d’un gène à un seul exon codant
- la séquence complète d u gène (avec plusieurs exons et introns)
- des régions régulatrices.
On prend des cellules dont on isole l’ADN, on choisit l’ADN à cloner, on sépare les brins et on ajoute les amorces, on amplifie
par PCR.

Un nombre croissant de génomes sont séquencés et annotés

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Gène avec un seul exon codant

Gène avec plusieurs exons codants

Le clonage de cet ADN peut se faire, mais l’expression dans une cellule procaryote ne donnera pas le message adéquat (dans
une cellule eucaryote l’expression pourrait être possible) → plutôt cADN.

3) Synthèse chimique d’oligonucléotides suivie d’un assemblage

Base de données (NCBI = National Center for Biotechnology Information) → séquence nucléotidique → synthèse
d’oligonucléotides (20 à 100 nt) → séquence codante double brin insérable dans un vecteur

De + en + utilisé, même pour des gènes de grande taille

Synthèse oligonucléotidique sur phase solide, synthèse de 3’ vers 5’. Technique automatisée utilisant un synthétiseur
d’oligonucléotides.

Obtention d’un gène synthétique :

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La synthèse chimique permet de tenir compte de l’usage de codons par la cellule hôte : codons sont-ils utilisés avec la même
fréquence, quelle que soit la cellule ?
 Pour un aa donné, une cellule donnée utilise préférentiellement certains codons.
Ex : codage Arg (en fréquence d’utilisation)

E. Coli K12 Homo Sapiens

CGU 0,38 008
AGG 0,02 0,21
 Usage des codons peut varier d’un organisme à l’autre

Comment corriger biais ?

- Manipuler bactérie :
o Expression dans staby = E. Coli modifiés pour usage de codons
o Expression dans rosetta : présence de tARB à anticodons rares
- Adapter les codons à la cellule utilisée pour l’expression → intérêt des gènes synthétiques

4) Obtention d’un fragment d’ADN par sous-clonage

- Enzymes de restriction
- PCR (classique ou asymétrique)
- Recombinases

Plasmide de clonage → plasmide d’expression

V. Cellules hôtes

1) Pour le clonage
- Escherichia coli le + svt
- Autres cellules (levures pour YACS, cellules de mammifères pour MACS)

2) Cellules hôtes eucaryotes (pour expression)

- Levures : Saccharomyces, Pichia pastoris
- Cellules d’insectes Sf9
- Cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian cells)
- HEK 293 : Human Embryonic Kidney cells
- Œufs fécondés
- Cellules souches embryonnaires : ES
- Cellules de plantes (tabac, carotte, …)

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