Vecteurs de clonage

= molécule d’ADN capable de se répliquer utilisée pour transporter un fragment d’ADN → amplification d’un
fragment d’ADN d’intérêt (insert ou « ADN étranger ») plus grand qu’en PCR

Plasmides
= ADN double brin circulaire pouvant se répliquer de façon autonome dans une bactérie et contenant un ou
plusieurs gènes
Caractéristiques
- Origine de réplication (ori)
- Site d’insertion pour l’ADN étranger : polylinker ou MCS (multiple cloning site)
- Gène de résistance aux antibiotiques pour sélectionner les bactéries avec le plasmide
- Gene d’identification interrompu par l’ADN étranger pour identifier les plasmides recombinants

Plasmide pGEM
- Gène de résistance à l’ampicilline
- Gène d’identification des recombinants : une partie de l’opéron lactose (LacZ α) interrompu par le MCS
- Promoteur T7 et promoteur Sp6 de part et d’autre du site de clonage → transcription in vitro
- Ouverture par des enzymes de restriction, fermeture par une ligase

Identification des bactéries avec le pGEM sauvage

Bactérie sans plasmide : gène Lac Z déficient → β-galactosidase inactive ∆LacZ, sensibles à l’ampicilline,
ne se multiplient pas
Bactéries avec plasmide sauvage : résistantes à l’amicilline (B-lactamase), ∆LacZ + LacZ α → activité de la
β-galactosidase visible par transfo X-Gal en X bleu et galactose → bactéries résistantes = bleues
α-complémentation : présence d’une activité β-gal si l’inhibiteur LacI est bloqué par du lactose ou analogue
(IPTG)

Identification des bactéries avec le plasmide pGEM recombinant

Bactéries avec plasmide recombinant : résistantes à l’amp (B-lactamase) et (∆lacZ + lacZ α) incomplet (à
partir du plasmide)
Pas de complémentation : pas d’activité β-gal même si l’inhibiteur lacI est bloqué. Test au X-Gal négatif →
bactéries résistantes à l’amp = blanches

Vecteur de clonage + plasmide TA

Extrémités 3’T dépassantes : ne peut pas se Extrémités 3’T dépassantes

refermer sur lui-même, insertion efficace de produits Couplage + phosphorylation de la topoisomérase à
de PCR (avec un A dépassant en 3’) catalysée par chaque T dépassant, aux extrémités 3’ du vecteur
la ligase. ouvert
Ligase → liaison covalente entre les extrémités 5’P Topoisomérase → liaisons phosphodiester
du vecteur (livré ouvert) et les extrémités 3’OH du covalente entre extrémités T 3’P du vecteur et
produit de PCR → recircularisation du plasmide extrémités 5’OH du produit de PCR
Plasmide pENTER
- 2 séquences de recombinaison (ATT des bactériophages) pour l’insertion de l’ADN étranger par
recombinaison (recombinase)
- 1 gène d’indentification des recombinants (cccdB) = gène de toxicité
Recombinaison entre attR et attL aux
extrémités de l’ADN a insérer avec
les mêmes séquences sur le
plasmide → insertion de l’ADN entre
ces séquences avec recombinase.
Possibilité de transfert de séquences
entre vecteurs : GATEWAY
(Invitrogen)

Phage λ
Cycle du phage λ

 Cycle lysogénique : insertion dans le génome bactérien par recombinaison entre des séquences
d’attachement attP et attB
Intégration via intégrase (Int) du phage et IHF (facteur d’intégration de l’hôte) → recombinaison spécifique
entre sites att du génome du phage et de l’hôte

 Cycle lythique : réplication et excision par recombinaison entre les séquences attL et attR
Excision via protéines Xis (recombinase, contrôle du sens de recombinaison), Int et IHF
Séquences de recombinaison = 4 types de séquences reconnues par les protéines de recombinaison : attB
– attP pour insertion, attL – attR pour excision. Coupure dans partie centrale palindromique identique pour
les 4 sites.
Génome du phage λ

 Séquence cos : extrémités sb cohésives (12 n) → circularisation de l’ADN

 Bras gauche : gènes de structure
 Bras droit : gènes de lyse des bactéries
 Région remplaçable : gènes de lysogénie, recombinaison et excision → région cible d’insertion
Distance entre 2 COS pour encaspidation correcte de l’ADN du phage : entre 36 et 51 kbp

Schéma de recombinaison

Vecteurs dérivés du phage λ

Encapsidation de l’ADN du phage et formation des particules virales

YAC (chromosome artificiel de levure) et vecteurs associés

Sert à la transformation des levures. Comportement similaire à un chromosome eucaryote (> 2000 kbp)

BAC : sert à la transformation de bactéries. Comportement similaire à un plasmide (300 kbp)

Cosmide : plasmide avec des séquences cos, encapsidé (45 kbp)