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Zeniou

Approches à haut débit pour le transcriptome

I. Introduction

1) Les différents types d’ARN

- mRNA
- rRNA (ribosonal)
- tRNA (transfer)
- siRNA
- miRNA
- piRAN …

2) Définition
Transcriptome = ensemble des gènes trasncrits et leur quantité dans une cellule ou un tissu à un stage
spécifique du dvpt, dans conditions physiologiques ou pathologiques
≠ génome : identique dans toutes les cellules et dans toutes les conditions

Pour mjté gènes → variations qui dpdent

- Stade dvpt
- Conditions physiologiques
- Conditions pathologiques

Objectif de son étude :

- Interprétation fonctionnelle du génome
- Identification constituants moléculaires cellules et tissus
- Compréhension mécanismes dvpt, physiologie des cellules
- Compréhension mécanismes dvpt pathologies
- Création catalogue des transcrits
- Détermination structure transcriptionnelle gènes (sites d’initiation, sens, épissage, modifs post-
transcriptionnelles)
- Quantification modifications lors dvpt ou pathologie
- Compréhension mécanismes biologiques (voies de signalisation)
- Classification pathologies (ex : ≠ types de cancers du sein : surexpression de certains R)
- Identification biomarqueurs
- Identification nvlles cibles thérapeutiques

II. Les principales techniques de l’expression génique

- RT-PCR en tps réel

- SAGE (serial analysis of gene expression)
- Puces à ADN Haut débit
- RNA seq
- Autres ….

1) RNA seq
= WTSS (whole transcriptome shotgun sequencing)
Technologie utilisant le séquençage à haut débit (NGS : Next Generation Sequencing) pour révéler la présence
et le niveau de l’expression des ARNs à partir d’un génome à un moment donné

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a) Stratégie générale

1- Extraire ARN des cellules :

o Préparation ARNm seulement : avec polyA chez eucaryotes
o Préparation de tous les ARN (ARN total)
2- Enlever ADN contaminant + décomplexifier échantillon = supprimer ARNr et ARNt : trop abondants
→ par déplétion par hybridation : on récupère ARNm + petits ARNs non codants
Q° à se poser : on ne garde que ARNm ? aussi ARN non codants ?

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3- Fragmentation ARNs
4- Reverse transcription : transforme ARNs en ADN complémentaire → nécessite amorces + reverse
transcriptase
Q° : efficacité, erreurs induites par reverse transcriptase ? = biais
5- Préparation ADNc pour séquençage : ajout adaptateurs + orientation des transcrits
Q° : quel est le brin original ? → techniques pour savoir quel est le brin transcrit
6- Amplification par PCR (dpd qté de matériel au départ) → peut aussi introduire biais (ex : fragments
riches en G et C – amplifiés que autres fragments → pb pour quantification)
Dvpt protocoles sans PCR : taux d’erreur encore élevé
7- Séquençage haut débit (pyroséquençage : Roche 454, Illumina …). Choix approche de séquençage : la
+ accessible, seq les + longues possibles

b) Analyse des données

1- Lecture brute
2- Enlever artefacts (enlever adaptateurs, seq simples répétées, ARNr si seq connue …)
3- Eliminer erreurs de séquençage : peut conduire à la perte des transcrits rares
4- Assemblage des transcrits : par rapport à génome de référence, assemblage de novo
5- Elimination erreurs post-assemblage
6- Quantification : nb de lectures pour chaque transcrit

2) Helicos
Pb avec reverse-transcriptase : erreurs, arrêt trop tôt, nécessite amorces, rarement : initiation transcription
sans amorces → séquençage ARN directement : Helicos

ARN → queue poly A déjà présente ou ajoutée → fixation sur support (ac oligont) : hybridation oligont avec
ARN → polymérase : complète seq complémentaire à queue poly A → ajout nt modifiés : fluorophore et linker
+ inhibiteur synthèse → empêche addition d’un nt supplémentaire (est enlevable pour continuer synthèse)
Lecture fluorophore → clivage fluorophore et inhibiteur → ajout d’un nouvel nt modifié → lavage → lecture →
etc.
Ajout des nt un à un : accumulation images de lecture

3) Analyse du transcriptome de cellules uniques

Isolement cellule :
- Par cytométrie : AC reconnaissent cellules → tri
- En fonction contenu cellules
- Méthodes optiques puis tri par pince optique
- PCR digitale : PCR sur une goutte
- En fonction taille + magnéto-électrophorèse
- En gardant cellule dans tissu : marquage tissu, sélectionner les cellules d’intérêt et les récupérer avec
laser

Séquençage sur très peu de matériel → étape de reverse transcription + amplification

Utilisation reverse transcriptase + fiable
Amplification par PCR, PCR en cercle roulant …

Intérêts :
- Etude différenciation cellules souches
- Compréhension mécanismes embryogénèse
- Etude hétérogénéité cellulaire dans tissu et fonctionnement tissu
- Diagnostic personnalisé et + rapide

Ex cancers : hétérogénéité entre les cellules, et entre les patients → étude transcriptome de chaque cellule :
dans tumeur de chaque patient, type cellulaires différents
Implication : classification des tumeurs → pronostics ≠ + orientation tts

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Avantages :
- Permet d’étudier des transcrits connus et inconnus (pas de séquence existante requise)
- Large gamme dynamique
- Peut être appliqué à toutes les espèces (même en absence de séquences du génome)
- Grande sensibilité et précision
- Qualité des données égale ou meilleure / aux puces pour un coût équivalent ou inférieur
- Permet d’identifier les sites d’initiation de la transcription
- Séquençage spécifique de chaque brin possible
- Permet d’étudier l’épissage alternatif
- Permet de détecter des transcrits provenant de la fusion de deux gènes