Technique de Biologie et Génétique moléculaire

 
 
=    Ensemble  des  opérations  qui  vont  de  l’isolement  des  gènes,    de  la  détermination  de  leur  structure,  de  leur  mutation,  a  leur  transfert  dans  les  
cell  ou  les  organismes.  
 comprendre  les  mécanismes  molecR  des  pathos  
 diagnostic,  dépistage  préventif,  therapie  génique  
 
Génome  humain  =  3  milliards  de  paires  de  bases.  
 
Une  cell  humaine  comporte  46K  (23  issus  de  la  mère  et  23  issus  du  père).  K  sexuels  ;  XX  chez  la  femme  et  XY  chez  l’homme.  
ADN  est  constitué  de  4  nucléotides  :  A  T  G  C  +  ribose  +  acide  phosphorique.  
 
A  partir  de  l’ADN    transcription  en  ARM  pré-­‐messagé  (ds  noyau)    ARN  messager  (ds  cytopl)    
  traduction  en  protéine.  
L’assemblage  de  nucléotide  forme  un  codon.  Un  codon  code  pour  un  aa.  Des  aa  forment  une  
protéines.  
Le  code  génétique  est  redondant  :plusieurs  codons  peuvent  coder  pour  un  même  aa.  (donnant    
ainsi  une  même  protéine).  
 
Impact  du  géni  génétique  :  Médical,  Recherche  et  Agriculture.  
 
 
 
I. Extraction  de  l’ADN  
 
Technique  permettant  d’isoler  l’ADN  des  cell,  des  T,  du  sang…  
Une  fois  extrait,  l’ADN  se  conserve  à  4°C.  
 
Etapes  :  
1) Lyse  de  la  cell  :  élimination  de  la  mb  plasmique  et  noyau  grace  aux  détergents  ou  choc  
thermique.  
2) Récupération  et  élimination  de  certaines  protéines  (via  phénol  et  chloroforme).  
3) Précipitation  et  purification  de  l’ADN  par  éthanol.  La  purification  consiste  à  éliminer  l’ARN.  
4) solubilisation  de  l’ADN  purifié.  
 
 
II. Les  enzymes  de  restriction  
 
Les  endonucléases  coupent  l’ADN  double  brin  au  niveau  de  sites  spécifiques.  
Origine  :  bactérienne  
Très  nbrx  (plus  de  500).  
Elles  reconnaissent  des  séquences  de  4  à  8  nucléotides.  
 
 
III. Electrophorèse  sur  gel  d’agarose  
 
Principe  =  séparation  des  fragments  d’ADN  en  fct  de  leur  masse  moléculaire.  
Les  fragments  migrent  sur  gel  et  sont  séparés  en  fct  de  leur  longueur,  de  leur  nbr  de  paires  de  base.  
 
L’ADN  est  chargé  (-­‐).  On  dépose  donc  nos  échantillons  dans  des  puits  au  niveau  de  la  cathode.    
Le  gel  est  soumis  à  un  courant  et  les  fragments  d’ADN  migrent  vers  l’anode  (+).    
Plus  le  fragment  est  court,  plus  il  migre  loin.  
 
 
Ex  :      
 
 
Digestion  de  l’ADN  génomique  par  une  enzyme  de  restriction  :  
Les  sites  de  restriction  (de  coupure)  ne  sont  pas  forcément  situé  aux  mêmes  endroits  chez  2  individus.  
 Polymorphisme  des  longueurs  des  fragments  de  restriction.  
 
En  labo,  on  used  dc  cette  technique  pour  différentier/comparer  des  molec  d’ADN    réalisation  d’empreintes  génétiques,  tests  de  paternité…  
Ex  :  Si  les  2  allèles  d’un  même  gène  migrent  à  la  même  distance,  l’individu  est  homozygote.  Si  les  distances  de  migration  sont  différentes,  cela  
signifie  que  le  gène  possède  2  allèles,  l’individu  est  hétérozygote.    
 
Individu  1  :  Il  présente  2  fragments  de  migration  de  2  et  3  kb    il  n’a  donc  que  l’allèle  1  (en  2  exemplaires)    homozygote  pour  ce  gène.  
Individu  2  :  Il  présente  3  fragments  de  migration  de  2,3  et  5  kb    il  possède  donc  l’allèle  1  et  l’allèle  2,  chq1  coupé    hétérozygote.  
Individu  3  :  Il  présente  2  fragments  de  migration  de  2  et  3  kb    il  n’a  donc  que  l’allèle  2  (en  2  exemplaires)    homozygote  pour  ce  gène.  
 
Ex  :    Le  père  a  donne  1  de  ses  allèles  a  chq1  de  ses  enfant.  On  recherche  dc  la  ligne  qui  partage  au  moins  1  trait  avec  les  autres  lignes.  
 
 
IV. Technique  de  transfert  et  de  détection  :  
 
On  détecte  spécifiquement  des  fragments  d’ADN  ou  ARN  ou  Protéines,  grâce  a  une  sonde  qui  va  s’  hybrider  uniquement  à  la  séqC  d’ADN  
recherchée.  
 
L’ADN  peut  comporter  tel  gène.  Mais  ce  gène  peut  ne  pas  être  transcrit  et  donc  ne  pas  s’exprimer  (on  ne  le  retrouverai  donc  pas  dans  l’ARN).    
L’étude  de  l’ADN  ne  nous  donne  pas  tt  les  indications  nécessaire.  L’ARN  nous  permet  de  voir  si  tel  gène  est  transcrit  et  donc  serai  
potentiellement  responsable  de  la  maladie.  
 
→ Northern  Blot  :  ARN  
→ Western  Blot  :  protéine.  
→ Southern  blot  :  ADN  
 
Etapes  Sourthern  Blot:  On  veut  savoir  si  l’ADN  du  patient  comporte  telle  séqC  (complémentaire  à  telle  sonde)  :  
 
1) Digestion  :  coupure  de  l’ADN  par  une  enz  de  restriction  
2) Electrophorèse  :  on  fait  migrer  les  différents  fragments  d’ADN  sur  gel  d’agarose  ;  
3) Transfert  sur  une  mb  de  nitro-­‐cellulose  +  Dénaturation  (ouverture  de  la  2ble  hélice  :  séparation  des  2  brins  d’ADN).  
4) Hybridation  à  l’aide  d’une  sonde  marquée  monobrin  :  la  sonde  (=  ADN  complémentaire  à  la  seqC  recherchée)  se  fixe  sur  la  région  
spécifique  d’ADN  et  la  révèle  à  l’aide  de  ses  chromophores.  
5) Révélation      de  la  sonde  d’ADN  (ex  :  par  RX  si  la  sonde  est  radio-­‐active).  
 
Idem  pour  l’ARN,  sauf  qu’on  rajoute  une  étape  préalable  qui  transforme  l’ARN  en  ADN  (synthèse  du  brin  complémentaire  au  monobrin  d’ARN,  
via  la  Transcriptase  inverse).  
 
Ex  :  On  étudie  l’ADN  spermatique  prélevé  sur  la  victime  d’un  viol.  On  test  plx  suspects.  On  recherche  la  colonne  de  migration  identique  à  la  
colonne  du  prélèvement.    C’est  le  sujet  1  (identique  au  puit  n°4).  
 
 
 
V. Hybridation  in  situ  
 
 
=  Utilisation  d’une  sonde  d’acides  nucléiques,  pour  localiser  dans  des  cell  ou  tissus  des  seqC  d’acide  nucléiques  (ADN,ARNm)  dont  les  bases  
sont  complémentaires  de  la  sonde.  
2  techniques  d’hybridation  in  situ  :  
 
 FISH  ;  la  révélation  se  fait  par  fluorescence  en  utilisant  un  marqueur  fluo  ou  un  marqueur  possédant  
un  site  antigénique  reconnaissable  par  un  Ac  couplé  à  un  fluorophore.  Observation  par  microscope  à  
fluorescence.  
 

 CISH  :  on  used  des  Ac  couplés  à  un  agent  coloré  dirigé  contre  la  sonde.  Observation  avec  microscope  
à  fond  clair.  
 
 diagnostic  pré-­‐natal,  dépistage  du  cancer  …  
VI. PCR  :  Technique  d’amplification  in  vitro    
 
PCR  =  Polymérase  Chain  Réaction.  
C’est  une  réaction  enzymatique  in  vitro,    qui  permet  d’amplifier  spécifiquement  une  séqC  nucléotidique  donnée.  
er
Elle  nécessite  une  amorce  (il  faut  donc  connaitre  les  1  nucléotides  de  la  seqC  à  amplifier).  
L’enzyme  used  =  ADN  polymérase.  
 
Le  milieu  doit  être  riche  en  nucléotides,  qui  seront  utilisés/asemblés  par  l’ADNp  pour  former  des  fragments  identique  à  la  seqC  étudiée.  
Un  cycle  =  Dénaturation,  Hybridaion,  Synthèse.  On  réalise  ainsi  plx  cycles    amplification  exponentielle  !  
 
Les  limites  de  la  PCR  :  
-­‐ il  faut  connaitre  la  séquence  à  amplifier.  
-­‐ attention  à  la  contamination  extérieure  (les  cell  du  chercheur  peuvent  venir  contaminer  l’échantillon  étudié).  
 
 
VII. Le  clonage  moléculaire  
 
BUT  =  isoler  et  obtenir  un  grd  nbr  de  copies  identiques  d’un  gène  ou  fragment  de  gène.  
Technique  :  on  introduit  un  gène  à  cloner  dans  une  cell  hôte,  via  un  vecteur,  la  cell  étant  capable  
d’exprimer  le  nouveau  gène.  
Vecteurs  :      Plasmide,  Phage,  Cosmide  
 
Etapes  :    
 
1) extraction  du  plasmide  à  partir  des  bactéries  
2) ouverture  du  plasmide  à  l’aided’une  enzyme.  
3) Extraction  du  gène  à  greffer  a  partir  d’ADN.  On  l’amplifie  
4) On  mélange  les  copies  du  gène  +  les  plasmides.  Les  2  vont  fusionner  grace  à  une  enzyme  :  ADN  ligase.  
5) introduction  des  plasmides  dansles  bactéries  (par  choc  électrique  (electroporation)  ou  thermique).  
6) Le  gène  est  reproduit  quand  la  bact  se  reproduit.  
 
 
Applications  :    
 
 
Banques  d’ADN  génomique  :  ensemble  de  clones  couvrant    
tt  le  génome  de  l’individu.  
 
Création  de  banques   Banque  d’ADN  complémentaire  =  ensemble  des  clones  
d’ADN  génomique  et   couvrant  tt  les  ARNm  d’un  individu.  
d’ADNc    
 

 
Identification  et    
amplification  dune    
seqC  d’ADN    
   
 (ex  :  gène  de  résistC  à    
la  pénicilline)  

Production  de  
protéines  codées  par  
les  gènes  insérés  

 
VIII. Séquençage    de  l’ADN  
 
=    Détermination  de  la  succession  des  nucléotides  composant  l’ADN  (nature  et  ordre).  
 
Méthode  de  Sanger  :  
Principe  :  copie  d’un  fragment  d’ADN  monocaténaire  que  l’on  désire  séquencer  via  ADNp  et  de  di-­‐désoxynucléotides  marqués.  
 
Les  di-­‐désoxynucléotides  ne  possèdent  pas  de  OH  en  position  3’  (sur  le  déoxyribose),    
ce  qui  bloque  l’allongement  delamolec  d’ADN  en  cours  de  copie.    
Ils  sont  marqués  avec  un  colorant  fluo.  
 
Dès  leur  introduction  dans  la  chaine  en  cours  d’élongation,  
l’élongation  s’arrete.  Le  bout  de  la  chaine  présente  donc  
une  certaine  fluorescence,  propre  a  1  des  4  nucléotides.  
 
 
IX. La  Puce  ADN  ou  Micro-­‐array  
 
La  puce  à  ADN  est  constituée  d’une  surface  solide  sur  laquelle  sont  fixées  les  molec  d’ADN  
servant  de  sonde.  Ces  sondes  fixent  spécifiquement  des  «  cibles  »  (fragments  de  gènes  
complémentaires).  
 
La  mise  en  contact  des  sondes  avec  leur  cible  s’effectue  grace  au  phénomène  d’hybridation.  
L’hybridation  sera  mise  en  évidence  par  un  signal  fluorescent.  
 
Principe  :  

 
 
 
 
 

 
 
 
 
Etapes  :  Comparaison  de  l’expression  génique  de  2  échantillons  cellR.  
 
1) Extraction  de  l’ARN  
2) Transfo  ARN  en  ADN  avec  la  Revers  transcription  avec  des  nucléotides  marqués  par  des  fluorochromes  diff.  
3) Hybridation  compétitivesur  les  lamelles  contenant  des  milliers  d’oligonucléotides  diff  connus.  
4) Lecture  des  lamelles  
5) Analyse  des  resultats.  
 
 
Applications  :  
→ analyse  (comparative  ou  pas)  d’expression  de  gènes  dans  des  conditions  déterminées  
→ cancer  :  comparaison  d’expression  de  gènes  entre  T  sain  et  T  cancéreux  
→ pharmacologie  ;  retentissement  d’un  médoc  sur  l’expression  des  gènes.