TD diagnostics moléculaires

But : mettre en évidence une mutation à l’origine de maladies génétiques. Exemple : familles à
risque
Amniocentèse : on récupère les cellules amniotiques = patrimoine génétique du bébé. On laisse
proliférer, et quand on en a assez, on extrait l’ADN.
Tests diagnostiques : au laboratoire, avec des tests très simples. Il faut que ça soit le plus fiable
possible (pas de faux positifs), rapide et peu cher.

1ère méthode = Southern blot : sonde = séquence d’ADN complémentaire, marquée par un
marqueur radioactif
• On digère l’ADN par des enzymes de restriction
• Electrophorèse sur gel d’agarose : on sépare les fragments selon leurs poids moléculaire
• Transfert sur une membrane de nylon. La membrane va être le miroir du gel d’agarose (car
la sonde ne peut s’hybrider que sur un support solide).
• Aujourd’hui sondes fluorescente ou bioluminescentes, plutôt que radioactives.
• On met la sonde dans un milieu liquide, elle va reconnaître son complémentaire.
• Après une nuit d’incubation, on va laver pour enlever les sondes non fixées.
• On met la membrane au contact d’un film photosensible, et la sonde qui s’est hybridée sur
son complémentaire va imprimer le film, on aura une marque noire.

2e méthode : Dot blot

On a une membrane commerciale, avec plusieurs carrés pour plusieurs patients. On extrait l’ADN et
on met une goutte directement sur la membrane. Puis on hybride avec une sonde radioactive.
Résultat radiographie :

PCR
Amplification d’un fragment
d’ADN
Marqueurs moléculaires =
fragments de taille connue
PCR quantitative : on utilise un intercalent fluorescent qui, à chaque fois que l’ADN est amplifié, va
donner un signal fluorescent, que l’on peut quantifier.

Exercices

Diagnostic de la mucoviscidose
ADN → PCR → Gel d’électrophorèse = gel d’agarose
2 bandes = hétérozygotes
Parents hétérozygotes, fille homozygote malade, fils homozygote sain
Parents sains donc maladie récessive

ΔF508 : délétion de 3 nucléotides CTT qui codent pour une Phénylalanine en position 508
Canal chlore plus fonctionnel

B) Mutation X542G
X = Gly (GGA) → Codon stop (TGA) en position 542
On peut pas utiliser la PCR parce qu’on a la même taille entre les séquences normale et mutée.
⇒ Méthode de Dot Blot

Sondes = oligonucléotides : petites sondes simple brin

On génère une sonde complémentaire de la séquence normale, et une sonde complémentaire de la
séquence mutée. Comme c’est une petite sonde, s’il y a un nucléotide qui change, il y a
mésappariement donc très spécifique.

Diagnostic de l’absence bilatérale des conduits déférents

On utilise un vecteur qui contient les exons qui nous intéressent, le vecteur va faire l’épissage lui-
même. Une fois qu’on a fait l’épissage, il va générer un ARNm.
On amplifie l’ARNm par RT-PCR, avec 2 amorces SD6 et SA2.
Taille attendue = 638 bp

Mutation : l’exon 9 n’est pas épissé → taille de 455 bp

Mutation dominante

Observation chez des patients d’une diminution de la séquence microsatellite qui conduit à la même
pathologie
→ Ce n’est pas l’exon 9 qui cause la maladie.

Dans un 2e temps : plasmide d’expression couplé à une activité luciférase. Séquence étendue (1,2
kb) → PCR. Activité transcriptionnelle = morceau d’ADN qui conduit à l’activation de la
transcription.
⇒ Diminution de l’activité transcriptionnelle

Le gène a une activité transcriptionnelle diminuée.

⇒ Les répétitions diminuées sont une séquence de régulation importante qui contrôle l’activité
transcriptionnelle. Il faut qu’il y ait 9 répétitions.

Diagnostic de l’hémochromatose
Il y a certaines mutations dans l’ADN présentes au niveau d’un site de restriction. La mutation
modifie le site de restriction, parfois il apparaît, parfois il disparaît. La taille obtenue entre le patient
sain et malade est différente = polymorphisme de longueur de fragment de restriction.
PCR
Taille de l’amplification par PCR
Maladie héréditaire récessive
+/+ : bande à 247 pb, bande à 111 pb → homozygote malade
+/ - hétérozygote : 3 bandes à 247, 140, 111 pb

Recherche du variant H63D :

Mutation = disparation du site de restriction
Homozygote sain : 2e puits

Diagnostic de la drépanocytose
Mutation au niveau du T : il y a un site qui disparaît
Il y a un site BsuI constant, qui n’est pas sujet à des mutations d’où le fragment c.
PCR avec une méthode de RFLP.

Méthode 2
Pour la même mutation, on fait la méthode Southern Blot.
Hétérozygote en D
Homozygote mutation en A

Diagnostic de la thalassémie
E = individu sain homozygote
B = homozygote mutation