• Le clonage de l’ADN – soit dans des cellules, soit in vitro

– permet à des molécules d’ADN d’être sélectivement

répliquées en un nombre de copies très élevé. Quand il
est amplifié par ce moyen, l’ADN est efficacement
purifié et le clonage de l’ADN permet d’étudier des
séquences ADN isolées de l’ADN génomique.

• L’hybridation des acides nucléiques : approche

complètement différente. Au lieu d’essayer de purifier
individuellement des séquences d’acides nucléiques,
l’objectif est de les détecter spécifiquement et de
suivre leur devenir au sein d’une population complexe qui
représente un échantillon biologique.
 I, Hybridation moléculaire:

Association de 2 acides nucléiques simples brins de séquences complémentaires

et qui conduit à la formation d'un double brin ou duplex par formation de liaisons
H entre ces deux brins.
Detection d'une molecule d'AND ou d'ARN dans un mélange contenant des
milliers de similaires: "trouver une aiguille dans une meule de foin"

On distingues les hybrides:

• ADN-ADN = Homoduplex
• ADN-ARN = Hétéroduplex

La formation et la stabilité des duplex dépendent de nombreux facteurs :

• la composition en bases
• Longueur des duplex
• complexité de la séquence.
 Hybridation moléculaire

ADN-ADN = Homoduplex

ADN-ARN = Hétéroduplex
 1) Principes de l’hybridation des acides nucléiques

Dans l’hybridation des acides

nucléiques, une population d’acides
nucléiques connus (SONDE) permet
d’analyser une population d’acides
nucléiques mal connus

 Une sonde est un ADN mono-

brin ou ARN, ayant une
séquence complémentaire à la
séquence à détecter.
 En s’hybridant avec sa
séquence cible, elle permet
de la détecter.
2) Types de sondes
 Sonde génomique: fragment obtenu par coupure de l’ADN génomique.
 Sonde ADNc : sonde ADN obtenue par transcription réverse d ’un ARNm
messager (= séquence codante).
 Sonde oligonucléotides : ADN (ou ARN) simple brin de 18 à 50 nucléotides
synthétisé chimiquement.

3)Facteurs ayant une influence sur l’hybridation

 La température: la température optimale d’hybridation est en général
inférieure de 25% à la Tm de la sonde. Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Ta = Tm-5
 La taille des fragments ou des sondes.
 La force ionique: l’hybridation est accélérée en forte concentration saline.
 La durée de l’hybridation : plus l’hybridation est longue, plus la rencontre
entre séquences complémentaires est favorisée
 3-a- La température de fusion de l’ADN Tm
(melting Température)

 C’est une température, appelée

également Température de demi
dénaturation (Tm) qui correspond
à l’ouverture ou au déroulement
de 50% de la chaîne de l’ADN
chauffé.
 C'est l'effet hyperchromique
qui correspond à la rupture des
liaisons hydrogènes (liaisons
faibles) et la séparation des 2
chaînes entraînant une
augmentation dans l'absorption
d'U.V de 40% à 260 nm.
 La valeur de Tm des ADN est
une fonction linéaire du
pourcentage de (G + C) de l'ADN
 II. Les agents de marquage des acides nucleiques (sondes)

Marquage : Méthode consistant à incorporer un nucléotide radioactif,

fluorescent ou modifié chimiquement dans une molécule d’acide
nucléique.

a) Isotopes radioactifs: qui permettent de constituer des sondes « chaudes »:

ex: Le P32 est le plus utilisé pour le marquage des nucléotides. Il émet des
rayonnements β qui vont impressionner des plaques photographiques lors de
l'autoradiographie

b) Marqueurs non-radioactifs: qui constitueront les sondes « froides » :

La détection des sondes froides est basée sur une réaction enzymatique
qui fera apparaître un produit coloré ou fluorescent ou bien une
production de photons. Ex: biotine (interaction covalente avec l’avidine),
digoxigénine (Ac-Ag) , fluorescéine (émet une lumière réfléchie de
fluorescence lorsqu'elle est excitée sous les ultraviolets)……
 III. Techniques de marquage des sondes

1) Nick translation (déplacement de brèche)

But: couper des petits bous d’ADN pour les

remplacer par de l’ADN marqué

a) Cassure aléatoire par une endonucléase , la

Dnase
b) Agrandissement des cassures parl’activité
exonucléase 5’—3’ de l’ADN polyI
c) Synthèse d’ADN grace à l’activité
polymerase de l’ADN poly I en utilisant des
dNTP marquées

Résultat: obtention d’un ADN bicatenaire

contenant des nucléotides marqués sur les deux
brins
2) Multi-Random priming= multi amorcage au hasard

But : synthèse de l’ADN marqué

a) Chauffage de l’ADNdbpuis refroidissement
brutal entrainant une séparation définitive
des 2 brins
b) Synthèse de façon aléatoire d’une multitude
d’amorces
c) Parmi ces amorces, certaines vont
forcement rencontrer leurs séquences
complémentaires sur l’un des brins d’ADN
d) Synthèse d’ADN par l’ADN poly en utilisant
des dNTP marquées

Résultat: obtention de 2 molécules d’ADN

bicentenaires (dont un seul brin est marqué par
molécule)
 3) Marquage aux extrémités
• Marquage 5’P: grâce à une polynucléotide kinase
Échange de phosphates par la polynucléotide kinase , en présence de γp32 d‘ATP,
la polynucléotide kinase échange le phosphate en 5’ de la sonde, ce qui permet de
la marquer.

• Marquage 3’OH: grâce à une polynucléotide kinase

La transférase terminale catalyse l’addition de désoxynucléotides sur une
fonction alcool 3’OH terminale de l’ADN
 Annexe:
Extraction et Purification de l’ADN
 ELECTROPHORESE DE L’ADN:

• Séparer des fragments d’ADN de différentes tailles en les faisant migrer dans un gel en les
soumettant à un courant électrique.

L'électrophorèse sur gel d'agarose

sépare les fragments d'ADN par taille.
Les molécules d'ADN chargées
négativement sont attirées par
l'électrode positive. Lorsque l'ADN
migre, les fragments d'ADN sont
empêchés par le maillage du gel
réticulé. Plus le fragment d’ADN est
petit, moins il risque d’être ralenti. Par
conséquent, les plus petits fragments
d'ADN migrent plus rapidement.

La charge relative étant constante, le système de discrimination entre les molécules est :
l'effet de filtration du gel utilisé « Tamisage moléculaire »
leur masse moléculaire ou nombre de paires de bases pb
L'électrophorèse sur

gel utilise un champ

électrique et des

électrodes positives et

négatives pour séparer

les molécules d'ADN en

fonction de leur taille.

• Le gel utilisé en électrophorèse est constitué d'une matrice de
polymère baignant dans un tampon conducteur.
• Deux principaux polymères sont utilisés : l'agarose (ADN:0,1-60kb)
et le polyacrylamide (ADN <0,1kb).
• La taille des mailles varie selon la concentration du gel d’agarose

Correspondance tailles des brins d’ADN/ concentration d’agarose

Séparation de
fragments d’ADN de
tailles différentes
dans un gel
d’éléctrophorèse
 Séparation d'ADN sur gel d'agarose: Les bandes d'ADN sur un gel de
coloration et standards polyacrylamide ou d'agarose ne sont pas
visibles si l'ADN n'est pas marqué ou coloré.

• Pour visualiser l'ADN, le gel d'agarose contenant les fragments d'ADN séparés est
plongé dans une solution de bromure d'éthidium, qui s'intercalera entre les paires
de bases de l'ADN (EtBr à la fois un agent intercalaire et fluochrome).
• Le gel est placé sous une source de lumière UV.
• La lumière ultraviolette excite le bromure d’éthidium et lui confère une
fluorescence orange.

Le bromure d'éthidium
se lie à l'ADN
bicaténaire par
intercalation.
La détermination de la taille d'un fragment se fait par rapport à la
migration d'un marqueur approprié contenant des fragments de tailles
connues (dans le puits de référence A).

Exemples de marqueurs de taille

- Phage λ coupé par BstEII (0.12 à 8.45)

- Phage λ coupé par HindIII (0.13à23.13)

- pBR322 coupé par BstNI (0.12 à 1.86)

- 100 pb Ladder (100 1000)

 Détermination de la taille des fragments d’ADN

Pour déterminer la taille d’un Marqueurs

Echantillon
de taille d’AND de
(en pb)
fragment d’ADN à l’aide d’un gel taille
inconnue

d’agarose, il suffit de tracer une

courbe de la taille des molécules
sur une échelle logarithmique en
ordonnée (l’axe des y) en fonction
de la distance de migration en
abscisse (l’axe des x). Le
marqueur de poids moléculaire
permet de tracer une telle
courbe, qui sera utilisée pour par rapport au puits d’inclusion

Distance de migration en fonction du

déterminer la taille de fragments logarithme de la taille des fragments d’ADN

inconnus.