Electrophorèse des AN

1- Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose

2- DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

3- SSCP : Single-Strand Conformation Polymorphism-

4- Eléctrophorèse en champ pulsé (ECP ou PFGE)

 Electrophorèse d’ADN

• Migration à travers la matrice du gel sous l'effet d'un champ électrique  :

• les AN chargés négativement migrent tous vers l’anode

• les molécules de petite taille se déplacent plus rapidement et migrent plus loin

• Pour l’ADN génomique de grande taille  gel d'agarose

• Pour les produits PCR  gel de polyacrylamide

 Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose

• Coulage du gel contenant du BET (cancérigène)

• formation des puits par un peigne
Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose

Peigne introduit avant solidification

pour former des puits
 Gel solidifié avec les puits formés

puits
 Dépôt de l’échantillon

• Dépôt
• des échantillons d’ADN
• d’un marqueur de PM
• Migration en Tp adéquat
Révélation sous lampe UV
du gel traité au BET
 Determination taille de fragment ADN

• Migration de marqueurs de taille

• Migration de fragments de taille inconnue
• Tracer la courbe Taille = f(dx)
• Déterminer par extrapolation graphique la taille de X
 PAGE des produits PCR
• produits PCR séparés sur PAGE qui permet une réticulation plus fine du gel (pores plus petits)
• dispositif expérimental est vertical (comme pour SDS PAGE)
Migration selon PM : les plus petits fragments migrent plus vite
• Utilisation de marqueurs de tailles MT
• Permet de contrôler si la PCR a fonctionné en produisant des copies du fragment d’ADN cible de
taille donné
 DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

• Principe basé sur propriétés de dénaturation des AN

• Permet séparation de molécules d’AN de même taille mais de séquence différente
• Dépôt échantillon d’AN sur gel contenant un gradient dénaturant (par exemple l’urée).

• Dans un gradient dénaturant :

• fragments d’ADN migrent d’abord sous forme double brin

• puis le gel changeant de composition de plus en plus dénaturant

les molécules d’ADN s’ouvrent, formant une structure avec branchements.

• changement de structure provoque l’arrêt de la migration

 DGGE
• Permet de détecter des polymorphismes ou des mutations sur de l’ADN de très petite taille

• Peut être appliqué à de longs fragments d’ADN, mesurant des centaines de paires de bases

• Ne requiert pas de connaissance préalable de l’existence de polymorphisme

 SSCP : Single-Strand Conformation Polymorphism

• Une molécule simple brin présente la propriété de former des structures secondaires par des
appariements internes de bases. Ces structures secondaires dépendent des séquences et produisent
des formes particulières pour chaque molécule simple brin

• SSCP étudie les structures secondaires formées dans un AN simple brin lors d’une électrophorèse
pratiquée dans des conditions non-dénaturantes.

• Les différences dans les structures secondaires conduisent les brins d’ADN à migrer de façon
différentielle dans le gel
 SSCP-Méthodologie

• séquence d’intérêt amplifiée par PCR

• produit PCR dénaturé à 94°C puis rapidement refroidi dans la glace

 Les molécules simple brin ne s’apparient pas mais forment des structures secondaires simples

• Les fragments réassociés sont ensuite soumis à une électrophorèse:

• Dans le cas d’un homozygote, on peut observer deux bandes, chacune correspondant à une
structure secondaire légèrement différente
• Dans le cas d’un hétérozygote, au moins quatre bandes peuvent être observées
 SSCP-
sauvage mutant

dénaturation

refroidissement
brutal

gel non dénaturant

 Eléctrophorèse en champ pulsé
(ECP ou PFGE)

• Développée par Schwartz et Cantor en 1984 afin de séparer de grandes molécules d’ADN (> 50 kb) que

l’électrophorèse classique en gel d’agarose ne permet pas de résoudre, même en diminuant au

maximum la concentration d’agarose.

• Alternance de l’orientation du champ électrique au cours du temps.

• Chaque changement de champ électrique réoriente la molécule d’ADN dans le gel augmentant ainsi la
probabilité que la molécule d’ADN soit orientée de façon à passer à travers les mailles du gel.

• Cette probabilité dépend de la taille de la molécule.

la vitesse de migration d’un fragment d’ADN dans le gel varie dans le sens inverse de sa taille.
FIN