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Chromatographie liquide haute

performance en conditions dénaturantes
V. Maréchal

L’analyse du polymorphisme a rendu nécessaire le développement d’outils performants permettant

d’identifier des variations mineures (jusqu’à un seul nucléotide) dans des régions couvrant plusieurs
centaines de paires de bases. Ce chapitre présente le principe de la chromatographie liquide haute
performance en conditions partiellement ou totalement dénaturantes. Mise en œuvre pour séparer l’ADN
simple ou double brin avec une très haute résolution, cette technique s’avère particulièrement bien
adaptée à l’analyse à haut débit du polymorphisme génétique.
© 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Polymorphisme génétique ; Homoduplexe ; Hétéroduplexe ; Mutation ; Allélisme

Plan
¶ Définition
¶ Principe
Utilisation de matrices de poly(styrène-divinylbenzène) alkylé pour
séparer les acides nucléiques
Effet de la température
¶ Étapes de la technique de DHPLC
Choix de la température
¶ Autres développements
■ Définition [1-3]
Les techniques d’analyse du polymorphisme génétique ont
connu un essor nouveau avec le séquençage complet de nom-
breux génomes, et en particulier avec celui du génome humain.
Il est progressivement apparu essentiel de développer des outils
permettant une analyse rapide, sensible et à haut débit des
variations génétiques. Ces variations sont le plus souvent des
modifications qui affectent un seul nucléotide sur des régions
pouvant atteindre plusieurs milliers de bases. La DHPLC
(denaturing high performance liquid chromatography), ou chroma-
tographie liquide à haute performance en conditions dénatu-
rantes est devenue l’une des techniques les plus puissantes pour
cribler des variations alléliques naturelles ou des mutations avec
une sensibilité aussi importante que celle du séquençage, tout
en permettant une automatisation qui autorise des criblages à
haut débit.
Cette technique reprend les principes généraux de la chroma-
tographie liquide à haute performance en incluant des modifi-
cations majeures qui permettent une séparation efficace des
acides nucléiques en fonction de leur taille et/ou en fonction de
la structure des duplexes d’ADN.
■ Principe
1 Utilisation de matrices
1 de poly(styrène-divinylbenzène) alkylé
pour séparer les acides nucléiques
1
Une étape essentielle dans la mise au point des techniques de
1
DHPLC a été franchie en 1993 par la synthèse et l’utilisation de
2 phases stationnaires composées de billes non poreuses de
2 poly(styrène-divinylbenzène) alkylé. Ces billes, d’environ 2 µm
3 de diamètre, sont hydrophobes et électriquement neutres. Le
squelette phosphaté de l’ADN étant chargé négativement, il ne
peut interagir tel quel avec la phase stationnaire (Fig. 1). Il est
donc nécessaire, pour le fixer sur ce support, d’ajouter aux
phases mobiles des molécules chargées positivement et pourvues
d’un large domaine hydrophobe : le domaine cationique peut
en effet interagir avec les charges négatives portées par l’ADN,
alors que la région hydrophobe permet d’établir des interactions
avec la phase solide. Le TEAA (triéthylammonium) - un ion
amphiphile - remplit cette double fonction : les ions ammo-
niums du TEAA établissent des interactions avec les charges
négatives de l’ADN alors les chaînes alkyl, hydrophobes,
interagissent avec les billes qui composent la phase stationnaire.
Les molécules d’ADN sont éluées par une concentration crois-
sante d’un solvant organique, l’acétonitrile, qui provoque la
désorption des ions amphiphiles et de l’ADN. Cette technique
permet une séparation à très haute résolution de fragments
d’ADN double brin par chromatographie. Les charges négatives
de l’ADN étant proportionnelles à la taille des fragments, les
molécules d’ADN les plus courtes sont éluées les premières. La
détection s’effectue en sortie de colonne par un détecteur UV
(254 nm).
Effet de la température
La rétention de l’ADN double brin sur la colonne est dépen-
dante de la température. Pour une température inférieure à
50 °C, l’ordre de sortie des fragments d’ADN suit précisément

Biologie clinique 1
90-60-0062 ¶ Chromatographie liquide haute performance en conditions dénaturantes

Figure 1. Utilisation de matrices de

poly(styrène-divinylbenzène) alkylé pour sépa-
rer les acides nucléiques.

l’augmentation en taille des fragments d’ADN. Lorsque la

température dépasse 50 °C, l’ADN double brin peut commencer
à se dénaturer (les deux brins se séparent partiellement), ce qui
modifie l’interaction entre l’ADN et la colonne. Les ADN
partiellement dénaturés sont élués avant les ADN double brin
non dénaturés. Cette propriété constitue l’une des bases de la
séparation des hétéroduplexes par la technique de DHPLC.

■ Étapes de la technique de DHPLC

Les ADN à analyser sont obtenus le plus souvent par PCR à
partir de deux régions génomiques qui peuvent présenter une
ou plusieurs différences entre elles. La région d’intérêt est
flanquée de deux amorces qui permettent d’amplifier deux
double brins, dont l’un porte une différence au moins (Fig. 2).
Les produits de PCR (sauvages et mutés) sont d’abord dénaturés
par chauffage, puis refroidis lentement. Au cours du refroidisse-
ment, quatre populations de duplexes se forment (Fig. 2) : deux
homoduplexes présentant un appariement parfait, et deux
hétéroduplexes. Les produits de PCR sont injectés dans une
colonne dont la température est maintenue avec précision. La
température de la colonne est un paramètre essentiel de la
séparation correcte des différents duplexes. Elle doit être choisie
de façon à ce que les mésappariements présents au sein des
hétéroduplexes entraînent un niveau de dénaturation partielle
supérieur pour les hétéroduplexes que pour les homoduplexes.
L’interaction des double-brins avec la phase stationnaire est
d’autant plus faible que le degré de dénaturation est important.
Par conséquent, les hétéroduplexes sont élués en premier lors de
l’injection d’un gradient d’acétonitrile. Ils sont détectés sous la
forme d’un pic (ou éventuellement de deux pics lorsque le
protocole permet la séparation des deux hétéroduplexes). Les
homoduplexes, mieux retenus par la colonne dans ces condi-
tions, sont élués avec retard. Ils apparaissent sous la forme d’un
ou de deux pics selon les conditions expérimentales (Fig. 3).

Choix de la température
La détermination de la température optimale de sépa-
ration peut s’effectuer de façon empirique. Un mélange
hétéroduplexe/homoduplexe est injecté de façon répétée à
une température de colonne augmentant de 3 °C dans chaque
essai, à partir de 50 °C. À 50 °C, les temps d’élution sont Figure 2. Technique de DHPLC.
identiques pour les deux espèces puisque l’élution ne dépend
que de la taille. À une température critique, plusieurs pics
apparaissent qui traduisent une dénaturation partielle plus homoduplexes peuvent se dénaturer. Il existe heureusement
importante des hétéroduplexes mal appariés sur une ou plusieurs programmes, dont l’un est accessible sur le site de
plusieurs positions. Si la température augmente, même les l’université de Stanford (http : //insertion.stanford.edu/

2 Biologie clinique
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Figure 3. Les homoduplexes

apparaissent sous la forme d’un ou
de deux pics selon les conditions
expérimentales.

melt.html) qui permettent de calculer une température
optimale en fonction de la séquence étudiée.
■ Autres développements
La technique d’HPLC dénaturante présente une excellente
sensibilité pour rechercher des mutations ou des variations
portant sur un seul nucléotide sur des régions allant de 150 à
750 paires de bases. La qualité des résultats dépend cependant
des conditions expérimentales (choix des colonnes, température
etc.) et de la composition en bases des régions analysées.
Les techniques de DHPLC ont fait l’objet de différentes
améliorations et/ou modifications. L’une d’entre elles est la
technique de « completely DHPLC ». Cette approche est destinée
à l’analyse de fragments d’ADN d’une taille de 50 à 100 paires
de bases. En conditions dénaturantes, la technique HPLC décrite
précédemment permet de distinguer deux simples brins d’ADN
de taille identique présentant une seule base de différence. Cette
modification permet l’analyse de régions polymorphiques
connues avec précision, en générant des simples brins d’ADN
par extension d’amorce, l’amorce étant positionnée juste avant
le site polymorphe étudié. La DHPLC peut aussi être combinée
avec des techniques d’électrophorèse capillaire, ce qui permet
d’accroître la vitesse d’analyse, le nombre d’analyses et la
sensibilité de la technique. Par ailleurs, la détection des ADN
peut être réalisée par fluorescence, notamment lorsque les PCR
sont générées à l’aide d’amorces marquées par des fluorophores.
■ Références
[1] Premstaller A, Oefner P. Denaturing HPLC of nucleic acids. (2002)
LC-GC Europe. Juillet 2002 (p. 1-10).
[2] Sivakumaran TA, Kucheria K, Oefner PJ. Denaturing high performance
liquid chromatography in the molecular diagnosis of genetic disorders.
Curr Sci 2003;84:291-6.
[3] Bosson G. Denaturing HPLC: the tool of choice for detecting single
nucleotide polymorphisms. Biomed Scientist 2002:1269-74.

V. Maréchal, Professeur des Universités (vincent.marechal@snv.jussieu.fr).

UMR7079, Université Pierre-et-Marie-Curie, Centre de recherches biomédicales des Cordeliers, 15, rue de l’Ecole-de-Médecine, 75270 Paris cedex 06,
France.

Toute référence à cet article doit porter la mention : Maréchal V. Chromatographie liquide haute performance en conditions dénaturantes. EMC (Elsevier
Masson SAS, Paris), Biologie clinique, 90-60-0062, 2008.

Disponibles sur www.emc-consulte.com

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