Outils Bio Mol Et App RI

cours resume de biochimie :14 5- Elimination des ARN (par traitement à la RNase-DNase
free)
outils de biologie 6- Dissolution dans une solution tampon et

conservation
moléculaire et Précautions Pour préserver l’intégrité de l’ADN
applications 1- Eviter l’hydrolyse par les DNases (exogènes ou endogènes)

Travailler proprement ® gants / matériel stérilisé / tampons stérilisés
®+ EDTA
I / Les techniques d’extraction : 2- Limiter les dégradations (cassures mécaniques)
sources d’ADN toute cellule nucléée Cellules animales ou végétale

Pas d’agitation trop violente / pas d’ultrasons pour lyser les cellules 3-
Leucocytes
Eviter la dénaturation thermique
Villosités choriales
- Ne pas exposer à T°C > 80°C
-longue conservation à T°C ambiante en eau distillée déconseillée Les
Cellules en culture :fibroblastes, amniocytes, lignées lymphoblastoïdes autres techniques
Prélèvements anatomopathologique
Tissus congelés
Goutte de sang Salting-out
Chromatographie échangeuse d’ions Automates
Racine de cheveux
Restes de momie, cadavre.... II / Les techniques de dosage ADN et ARN :
principe d’extraction :
1- Affinité des acides nucléiques pour Les phases aqueuses Spectre d’absorption des Acides nucléiques
Solubilité différentielle entre 2 phases non miscibles 2- Précipitation Concentration ADN en mg / ml= DO260 x 50 x dilution
des acides nucléiques
Concentration ARN en mg / ml= DO260 x 40 x dilution Rapport de
(par l’éthanol ou isopropanol à froid / sels) pureté = DO260 / DO280. 1,8 – 2
Maximum d’absorption à 260 nm
Techniques d’extraction (ADN / ARN) Approche Globale courbe de fusion
Lyse cellulaire (par action des détergents) Dissociation des protéines
nucléaires L'ADN absorbe à 260 nm (bases puriques et pyrimidiques).
lorsque l'on chauffe l'ADN, la viscosité diminue et la densité optique à
(par action Protéinase K + SDS) 260 nm augmente :
Purification (par extraction au phénol-chloroforme)
principe : solubilité différentielle entre 2 phases non miscibles
➨ C'est l'hyperchromicité ou effet hyperchrome.
Précipitation des acides nucléiques
(par l’éthanol ou isopropanol à froid / sels)
Elimination des ARN Ceci est dû à la séparation des 2 brins d'ADN appelée fusion.
(par traitement à la RNase-DNase free) Température de fusion ou de Tm = le point de transition où la moitié
Dissolution dans une solution tampon et conservation des brins sont
dissociés (donc fonction de GC et AT).

1- lyse cellulaire (par action des Dénaturation - Renaturation = fonction de la composition en bases
détergents) nucléotidiques
1-Lyse des GR En TLP ou SLR (Tampon Lyse des Rouges / Solution

III / Les outils enzymatique :
Lyse des Rouges)
KHCO3 10 mM – NH4Cl 155 mM – EDTA 1 mM - pH=7,4 Bactéries (1970) Endonucléases de classe II :hydrolysent les liaisons
2-Lyse des GB En TLB ou SLB (Tampon Lyse des blancs) phosphodiester ; Reconnaissent spécifiquement séquences
palindromique 5’-G / AATTC-3’ / 3’-CTTAA / G-5’
Les coupures à bouts francs ou bouts cohésifs
Tris-HCl 10 mM pH 8 –NaCl 400 mM – EDTA 2 mM
Autres enzymes utilisés en biologie moléculaire

2- Dissociation des protéines nucléaires
- ADN polymérase (isolée en 1958)
(par action Protéinase K + SDS) - Terminale transférase
- Transcriptases inverses Transcrire l’ARN en ADNc - DNA Ligase
une Purification au Phénol-Chloroforme-Alcool IsoAmylique une
- Nucléases :
Purification au Chloroforme-Alcool IsoAmylique (24v / 1v) 4- DNaseI EndonucléasecoupeADNsimpleetdoublebrinCoupeaprès
Précipitation par l’éthanol pyrimidine ;Origine : extraite du pancréas
Nucléase S1 Dégrade spécifiquement les simples brins ADN
bicaténaires et hybrides ADN-ARN ne sont pas attaqués
xonucléase III
RNases
RNases A clive ARN simple brin (pas le duplex ADN-ARN) Résiste à
forte température (1h à 90°C)
RNases H clive ARN dans les hybrides ADN-ARN Destruction ARN
après transcription inverse (synthèse cDNA) Les autres enzyme
T4 polynucléotide kinase
Phosphatase alcaline (retire les P en 5’ sur ADN et ARN..)
IV/Les techniques de séparation :
1- Principe : c’estbune méthode de séparation des protéines et des

acides nucléiques (ADN, ARN) en fonction de leur taille.
Electrophorèse de ADN et ARN en gel d'agarose : Les acides
nucléiques chargés négativement sont déposés sur un support (agarose
ou acrylamide) et séparés par migration sous l'effet d'un champ
électrique.
2- Gels utilisés- Agarose

- Acrylamide
3- Courbe d’étalonnage Détermination de la taille des fragments

d’ADN
3- Purification (par extraction au
phénol-chloroforme)-
E
V/Les techniques d’analyse :
RFLP Southern ou Northern blots Amplification du DNA par PCR

séquençage d'acide nucléique
Southern blot :
1-Eléctrophorèse :
1- Restriction enzymatique
2- Electrophorèse sur gel d’agarose
3- Traitement du gel (dénaturation/dépurination)
4- Transfert sur membrane de nylon (cellulose) (Blot) 5- Hybridation
avec sonde spécifique marquée (P32) 6- Autoradiographie
Les méthodes d’études de l’ADN et de l’ARN
PCR et Techniques dérivées :

2- Autres méthodes de séparation : Reaction de PCR ou Polymerase chain reaction ( PCR ) :
Chromatographie (ACP : Amplification en Chaîne par Polymérisation)
Facteur d’amplification attendu 230 ® Facteur d’amplification réel 105

les cycles successifs de PCR
Augmentation exponentielle du nombre de copies 2n®30 cycles®106
Quantité initiale de l'ordre du pgr® quantité finale de l'ordre du μgr
Rôle des composants de la PCR
L’ADN polymérase :
Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie
thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par
exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase).
De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui

simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été
largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles.
Le tampon :
Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du

milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl
à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg2+,
cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la
Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations
bivalents Mg2+ et de cations monovalents (K+ ou NH4+) vont
neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au
niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En
pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec
l’activité de l’ADN polymérase.
ADN
on utilise souvent de l'ADN génomique (100 ng) total extrait de

cellules.
Sources d’ADN :
Sang total / Cellules en culture / Trophoblaste / Liquide amniotique / -
taches de sang séché
Biopsies tissulaires / taches de sang séché

Pièces de musées (animaux) / plantes séchées / prélèvement de momies
égyptiennes
En théorie une copie ADN recherchée est suffisante
pour avoir une amplification (sauf probabilité.....)
En pratique plusieurs copies sont nécessaires !!!
Attention, la mauvaise qualité et/ou une quantité ++ amplification non
spécifique
inhibition polymérase (due aux réactifs et contaminants).
Paramètres affectant la PCR
Dénaturation :
températures de 91 à 97°C.
Complementarité des bases G® C et A® T ou U
Liaisons hydrogènes
Formation d’hybride : double liaison stable / anti-parallèle
Taq polymerase demie-vie 30 min à 95°C
Temps à température de dénaturation
1minà 94°C(30sec)
Innis and Gelfand (1990) ® 96°C pendant 15 sec.
Amorces ou oligonucléotides
Le choix des oligonucléotides

Complémentarité / Spécificité
Tm* ou « melting temperature »
Programme informatique « logiciel OLIGO 4.0 »
- composition équilibrée en GC / AT
- peu d’écart entre les Tm des 2 amorces
- pas de complémentarité entre amorces / en 3’
Température d’hybridation Tm :
Elle dépend directement de la Longueur et de la séquence

Tm = 4°C x (nombre de bases G, C) + 2°C x (nombre de bases A, T)
Tm=4(G+C)+2(A+T) °C
La température d'hybridation est choisie généralement égale ou
supérieure de 2 à 3°C à la température de fusion de l'oligonucléotide.
(5°C de la Tm la plus basse pour Innis and Gelfand, 1990).
Temps d’hybridation : 30 sec ou moins
Les nucléotides dNTP (3) DésoxyNucléotides-Tri-Phosphates dATP
100 mM
dCTP 100 mM
dGTP 100 mM
dTTP 100 mM
La Taq polymérase
ADN polymérase thermostable 1987 Thermus aquaticus (Taq) ou
enzyme produite dans E. coli (génie génétique)
Dénaturation; Hybridation; Extension;
X 25-35 cycles
- Révolution ®la génétique moléculaire ® méthode d'amplification Extension finale
génique in vitro, Stockage à + 4 ° C
- l'analyse rapide et peu coûteuse des gènes, Thermocycleur:
appareil automatique assurant la variation de température rapide entre
La PCR a révolutionné la Biologie Moléculaire, la quantité d’ADN des plateaux programmés le nombre de fois requis
n’est plus un facteur limitant.
Juger les échantillons par électrophorèse sur gel. PCR®Electrophorése
Amplification d'un fragment d'ADN = nombreuses copies sur gel d’Agarose®Visualisation en UV ® produit final
Méthode simple, rapide, sensible,nécéssitant des ingrédients simples et Dans des conditions expérimentales
quelques heures de travail.
Outil de base à différentes techniques Au début de PCR
Cycle PCR
Étape 1: Dénaturation : Cassure des liaisons hydrogène par la
chaleurEtape2: Hybridation : Les paires de primers hybrident aux - excès d’amorces
extrémités de la séquence cible - excès de dNTP
Étape 3: Élongation : l’ADN Polymérase Taq catalyse l’extension des - concentration ADN est très faible.
amorces (incorporation des nucléotides complémentaires))
Fin du 1er cycle PCR : Obtention de deux copies de la séquence 93°C - 95°C 30 secs – 1min 37°C - 65°C 30 secs – 1min 70°-75°C
ciblePCR à 30 cycles®2n 1min
En théorie et seulement en théorie!
il y a un facteur d’amplification de l’ordre de 230 2-10 min
soit un facteur d'un milliard 109
En pratique : Préparation du Mix = mélange de: (Tampon; dNTP, Mg,
Mn, Taq et amorces
Ajout de l’ADN ( Cible) au Mix
programme du cycle
Dénaturation initiale 5 min à 94 ̊C
Difficulté : probabilité de rencontre des amorces avec l’ADN.
Evolution de PCR
- Copies d’ADN s’accumulent. ®modification du milieu réactionnel. -
Viscosité du milieu réactionnel augmente,
- Diminution des Amorces et des dNTP.
R° polymérisation = R° phosphodiester® [PPi] ++®inhibition
polymérase
En fin de PCR
- Conditions de plus en plus défavorables à Polymérase
- On comprend alors que le nombre de cycles est limité
fonctionne de manière optimale à 72°C (68°C) ;résistante à 95°C. peut

être ajoutée au début de la réaction 1 à 2,5 U
Vitesse 1000 bases/minute
Activité ADN polymérase thermostable
activité 5'®3' polymérase et 5'®3’exonucléase,

pas d'activité 3®5' exonucléase (ne corrige pas)
A une activité terminal transférase (ajoute un A) en 3'-OH
Problèmes de la PCR
1/ Contamination Polymorphisme de conformation : SSCP, DGGE, dHPLC hétéroduplex
2/ Fidélité 2-Séquençage
3/ Amplifications parasites
Polymorphisme de conformation simple brin
1/ Contamination : SSCP selon Orita et al. 1989 C’est une méthode
d’électrophorèse
ADN génomique +
Produits PCR +++ qui révèle des polymorphismes de conformation
Manipulation (pipettages, ouverture tubes...) Principe :
Solutions 2 molécules simples brins issues de la dénaturation d’un ADN
1-Organisation: Séparation de pièces : Extraction / réaction PCR / bicaténaire adoptent chacune en se renaturant une conformation
Amplification
en fonction de leurs séquences . Protocole :
2-Manipulation: 1-PCR (dCTP-a32P) / amorce marquée)
Aliquoter les réactifs
Utiliser des pipettes différentes pour PCR et produits PCR Porter des
gants, utiliser des pointes stériles.... PCR patient / PCR témoin
Survenue de novo : 30 % Dénaturation /Refroidissement brutale

2-Maintenir les produits dans une solution limitant la renaturation et
PCR+Digestion enzymatique Diagnostic de la Drépanocytose donc favorisant l’adoption d’une conformation particulière. 3-
Electrophorèse en gel d’acrylamide non dénaturant (apprécier le
Drépanocytose « shift » ou glissement des bandes)
Anémie falciforme dûe à Hb S 4- Séchage et Autoradiographie
Mutation ponctuelle unique (GAG®GTG) Avantages:
Responsable du changement de : Glu (HbA) ®Val (HbS) Détection par Simple et rapide
Southern blot (MstII/sonde) Ne nécessite pas d’équipement spécifique
ASO (Allele Specific Oligonucleotide) Saiki, 1985 Hybridation
classique Southern Limites:
En pratique Taille limitée du fragment à analyser (200 à 400 bp) Ne détecte pas
Amplification par PCR toutes les substitutions
Dépôts sur 2 membranes de nylon (2 allèles)
Dot blot - Slot blot5 ml ( 33 ng) produit PCR
2 Sondes marquées (pour l’allèle normal et anormal) Hybridation / 5x
Denhardt / 0,5x% SDS Autoradiographie
RT PCR : Reverse Transcriptase PCR,
utiliser les ARN comme matrice d'amplification de la PCR. détecter les

ARNm et éventuellement les quantifier
souvent réalisée in situ (PCR in situ) utilisée aussi
pour la construction de banques d'ADNc,
le tri d'ARNm (Differencial Display RT-PCR)

ainsi que la construction de sondes d'ADN.
1/ A partir de l'extrémité 3' et grâce à une amorce poly(T), la
transcriptase réverse synthétise un brin de DNA complémentaire du
messager.
2/ on dégrade le RNA par une base forte ou par une ribonucléase
spécifique.
3/ Le brin de DNA fabriqué forme spontanément à son extrémité 3' une
boucle en épingle à cheveux en s'hybridant sur lui-même.
4/ L'extrémité 3' de cette boucle va servir de site de démarrage pour la
DNA polymérase , qui va synthétiser un brin de cDNA du premier.
5/ Une ribonucléase spécifique du DNA simple brinsupprimera la
boucle de l'extrémité: 3-Réaction:
Techniques de recherche de nouvelles mutations :
2/ Fidélité :
Techniques de mise en évidence de variants
de séquences - Utiliser un contrôle négatif -Ajouter l’ADN en dernier
Erreurs :fréquence de 2/10.000 nucléotides par cycle. taux d'erreur

Stratégie :
après 30 cycles de l'ordre de 0,25 %.
Technique d’orientation / screening®permet de révéler la présence
Solutions
d’un variant de séquence !! Sans connaître sa nature !!
Diminuer la concentration en nucléotides, en ADN
Technique de confirmation de la nature du variant de séquence ® Utiliser de nouvelles polymérases : Vent, pfu....
Séquençage
choix des techniques 3/ Amplifications parasites
1- Méthodes qui reposent sur des différences de mobilité Souvent non détectables car non exponentielles
électrophorétique générées par les variants de séquence Solutions
Augmenter la stringence (t°C)
Ajouter du DMSO, du formamide ...
Hot start
Mise au point technique +++
Applications de la PCR :
La PCR a été adaptée à la mise en évidence et à l'analyse des mutations
dans de l'ADN eucaryote
Ces mutations peuvent être :

soit des délétions,
soit des insertions,
soit des substitutions de nucléotides (mutations ponctuelles). détectées
en testant la taille du produit PCR
Si on veut mettre en évidence une mutation ponctuelle, il faut

généralement séquencer le produit PCR puisque cette mutation ne va
pas changer la taille du produit obtenu, ou bien mettre au point des
techniques alternatives pour leur détection.
Applications de la PCR dans la détection de mutations :
PCR et détection de « délétions »
PCR multiplex
PCR + restriction enzymatique
ASO (Allele Specific Oligonucleotide)
détection de délétions
La mise en évidence de délétion par PCR Sur gel d’agarose 1-2%
Fonction de :
-Taille de délétion
- Résolution du gel
PCR multiplex :
Myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) CLINIQUE

Dystrophies musculaires progressives Mode de transmission:
Récessive, liée à l'X
- DMD :
- BMD :
GENETIQUE DMD & BMD : Deux maladies, un seul gène en Xp 21
Pénétrance complète
Incidence : 1 / 3 500 naissances de garçons
Le gène 2400 kb / 79 exons Les mutations

Délétions : 60%
Duplications : 5%
Mutations ponctuelles : 35 %
Polymorphisme de conformation en gradient dénaturant
selon Myers et al. 1987
Basée sur la séparation des fragments d’ADN double brin en fonction
de leur composition et de leur séquence au sein d’une région donnée.
Notion de dénaturation
-Ou transition d’hélice en pelote statistique, consiste en la séparation

de bases appariées A//T et G///C.
-On peut suivre la dénaturation de l’ADN en mesurant la DO260nm
Notion de Température de Fusion
Tm = 50% de liaison H rompues

Tm : varie en fonction de la composition en GC + conditions
expérimentales.
Tm propre à chaque séquence.
DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(Acrylamide + Formamide)
Basée sur la séparation des fragments d’ADN double brin, obtenus par
PCR, en fonction de leur composition et de leur séquence au sein d’une
région
ARNm: 14 kb Approche
1- L'A.D.N migre dans un gel d'acrylamide où il rencontre des
conditions de plus en plus dénaturantes (gradient dénaturant).
2- La dénaturation du double brin d’ADN se fait progressivement et de
façon discontinue de domaine en domaine, qui s'ouvrent plus ou moins
rapidement, en fonction de leur composition en bases AT et GC.
Mise au point technique de DGGE :
Analyse informatique du fragment d’intérêt : MELTMAP
1-courbe de fusiondoit avoir 2 domaines de fusion 2-choix des

amorces
3-détermination des conditions d’électrophorèse
PCR
Dénaturation / renaturation®formation Hétéroduplexes Electrophorèse

en gradient dénaturant
Analyse des résultats :
Après migration, démouler et colorer au BET
Lecture
HZ normal®1 bande (homoduplexe normal)
HZ variant ou muté®1 bande (homoduplexe muté) Htz simple® 4
bandes -- homoduplexe normal
-- homoduplexe muté
-- 2 hétéroduplexes possibles Htz composite ®4 bandes -- 2

homoduplexes mutés
-- 2 hétéroduplexes possibles
WAVE® System – Définition
1Extraction 2PCR 3Seq. réaction

La DHPLC est une méthode de pré-analyse pour la recherche de
variations génétiques (insertion, délétion, substitution).
Cette technique est utilisée pour la recherche de mutations inconnues

(Screening), ou connues (Scoring).
Principe
Les produits amplifies de deux différents allèles, substitution AG, sont
dénaturés et renaturés progressivement pour favoriser la formation
d’Hétéroduplexes.
Les espèces présentes dans le mélange PCR ont la même tailles. Elles
différent l’une de l’autre par leur stabilité en température.
Marqueur du chromosome Y, sY81 (DYS271) avec une mutation A-
vers-G en position 168 d’un fragment de 209-pb
Les Hétéroduplexes sont élués plus tôt que les Homoduplexes pour des
températures comprises entre 54 to 58oC.
PCR en temps réel
Principe:
Technique fondée sur la détection et la quantification du signal

fluorescent émis par un fluorophore dont l’intensité de l’émission est
proportionnelle à la quantité du produit amplifié au cours de la PCR
Avantages:
Grande sensibilité et spécificité
Réduction des risques de contaminations ( tubes fermés)
Capacité de multiplexage ( analyse d’un grand nbr Ech/PCR) Rapidité

de l’amplification ( 30 à 60 min pour 30cycles) Capacité d’analyse
quantitative et qualitative des AN Analyse à haut débit
Les différentes chimies utilisées en PCR en temps réel Les agents

intercallantsLSYBR-Green)
Les sondes d’hybridation:
Sondes Taq-Man ( Sonde à structure linéaire)

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cours resume de biochimie :14 5- Elimination des ARN (par traitement à la RNase-DNase

outils de biologie 6- Dissolution dans une solution tampon et

applications 1- Eviter l’hydrolyse par les DNases (exogènes ou endogènes)

sources d’ADN toute cellule nucléée Cellules animales ou végétale

dissociés (donc fonction de GC et AT).

1-Lyse des GR En TLP ou SLR (Tampon Lyse des Rouges / Solution

Autres enzymes utilisés en biologie moléculaire

IV/Les techniques de séparation :

1- Principe : c’estbune méthode de séparation des protéines et des

2- Gels utilisés- Agarose

3- Courbe d’étalonnage Détermination de la taille des fragments

V/Les techniques d’analyse :

RFLP Southern ou Northern blots Amplification du DNA par PCR

PCR et Techniques dérivées :

Chromatographie (ACP : Amplification en Chaîne par Polymérisation)

Facteur d’amplification attendu 230 ® Facteur d’amplification réel 105

De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui

Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du

on utilise souvent de l'ADN génomique (100 ng) total extrait de

Biopsies tissulaires / taches de sang séché

Le choix des oligonucléotides

Elle dépend directement de la Longueur et de la séquence

fonctionne de manière optimale à 72°C (68°C) ;résistante à 95°C. peut

activité 5'®3' polymérase et 5'®3’exonucléase,

Survenue de novo : 30 % Dénaturation /Refroidissement brutale

utiliser les ARN comme matrice d'amplification de la PCR. détecter les

le tri d'ARNm (Differencial Display RT-PCR)

Erreurs :fréquence de 2/10.000 nucléotides par cycle. taux d'erreur

Ces mutations peuvent être :

Si on veut mettre en évidence une mutation ponctuelle, il faut

Myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) CLINIQUE

Le gène 2400 kb / 79 exons Les mutations

-Ou transition d’hélice en pelote statistique, consiste en la séparation

Tm = 50% de liaison H rompues

1-courbe de fusiondoit avoir 2 domaines de fusion 2-choix des

Dénaturation / renaturation®formation Hétéroduplexes Electrophorèse

-- 2 hétéroduplexes possibles Htz composite ®4 bandes -- 2

WAVE® System – Définition

1Extraction 2PCR 3Seq. réaction

Cette technique est utilisée pour la recherche de mutations inconnues

Technique fondée sur la détection et la quantification du signal

Capacité de multiplexage ( analyse d’un grand nbr Ech/PCR) Rapidité

Les différentes chimies utilisées en PCR en temps réel Les agents

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