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Absorption de la lumière UV
À 260 nm l’ADN monocaténaire absorbe plus que l’ADN bicaténaire c’est l’effet
hyperchrome (Figure 4).
Effet hyperchrome
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Tm en °C =69,3+0,41 (%G+C)
Longueur du fragment
Composition en bases azotées
Présence de mésappariement
Force ionique
pH
Agent dénaturants
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La dégradation d’un polynucléotide peut être due par des agents chimiques ou
enzymatiques, elle concerne l’enchainement phosphodiester ainsi que les unités
nucléotidiques (composants et liaison).
Produits d’hydrolyse
Type d’hydrolyse chimique
ARN ADN
Alcaline Nucléosides monophosphate. ------------------
Acide :
*pH 1+chaleur
Pentoses+phosphates+bases.
5’ G/AATTC 3’
Séquences palindromiques
3’ CTTAA/G 5’.
Centre de symétrie
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Extraction et purification
Traitement par l’ARNase pour éliminer les ARN et récupérer les ADN.
Traitement par l’ADNase pour éliminer les ADN et récupérer les ARN totaux.
Réalisation d’une ultracentrifugation en gradient de densité pour séparer
l’ADN de l’ARN puis récupérer chaque AN à part.
Aussi dans le but d’éliminer les ADN et purifier un type spécifique des ARN
qui sont les ARNm possédant une queue poly A l’utilisation d’une
chromatographie d’affinité est recommandé ; dont la phase fixe est
pourvue de fragments d’oligo (dT) cellulose ou de poly (dU) sepharose de
quelque dizaines de nucléotides cette dernière peut s’hybrider avec les
ARN polyA.
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Précipitation
Précipitation à l’alcool éthylique : il faut ajouter à un volume de solution au
moins deux volumes d’éthanol + une quantité importante de sels et placer la
solution à froid. Le culot d’AN est obtenu après centrifugation à très grand
vitesse (5000g pendant 30 min).
Quelle que soit la technique de précipitation utilisé, le précipité est lavé avec de
l’éthanol à 70% afin d’éliminer les sels ou l’isopropanol passent en solution (se
trouvent dans la phase aqueuse) puis centrifugé pendant 15min, et séché dans le
but d’éliminer l’éthanol de lavage.
NB : il faut éviter toutes destructions enzymatiques des AN. Ces derniers qui sont
stables dans une cellule vivante deviennent très vulnérables à la digestion par les
nucléases endogènes et exogènes une fois la cellule est morte. Pour ce faire, les
échantillons sont:
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Technique
Dans la pratique, les acides nucléiques sont extraits et purifiés à partir de matériels
biologiques par différentes méthodes qui doivent être adaptées selon la nature du
matériel biologique.
Extraction d’ADN
A partir d’échantillon sanguin
1- Le sang est collecté dans des tubes EDTA.
2- Lyse des globules rouges par la méthode congélation/décongélation suivie
d’un lavage, avec un grand volume d’une solution hypotonique de lyse
(Tris/HCl/EDTA).
3- Des lavages par la même solution suivie d’une centrifugation seront
répétés.
4- Le culot leucocytaire est repris dans un tampon de lyse des GB
(Tris/HCl/EDTA, SDS, pH=8) puis traités par un mélange de détergent SDS
ou sarcosyl.
5- L’extraction est poursuivie par un traitement avec la protéinase K puis
avec le mélange phénol-chloroforme.
A partir d’échantillon cellulaire : les cellules doivent préalablement
être lysé au moyen d’un homogénéisateur de potter en présence d’un
détergent (SDS), le protocole est ensuite identique à celui mentionné ci-
dessus pour le cas d’extraction à partir d’échantillon sanguin.
Extraction d’ARN
La méthode la plus utilisé est celle décrite par Chirgwin (1979), dont laquelle
les échantillons sont homogénéisés le plus rapidement possible dans un tampon
qui contient en général :
Un détergent : SDS ou sarcosyl,
Un agent dissociant : thiocyanate de guanidine « GuSCN »
Un agent réducteur : le 2-mercaptoéthanol ou dithiothréitol « DTT »
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Conditions Composés
Pentoses Réactifs
expérimentales formés
Milieu acide concentré
Chaleur Vert mesurable à
Riboses Réactif de Bial ou l’orcinol
Ion Fe3+ 590nm
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Électrophorèse
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Technique
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A B
D C
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La détermination de la taille des fragments est faite suite à une comparaison avec
le marqueur de taille moléculaire en se basant sur la droite log de la masse
molaire=nombre de Kb en fonction de la mobilité des fragments (Figure 9).
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Gel d’électrophorèse
L’agarose : polymère à base d’agar purifié, c’est le support le plus
utilisé pour la séparation des grands fragments, dans des dispositifs
électrophorétiques de position horizontale. Différentes puretés
d’agarose sont disponibles.
L’acrylamide : est le nom usuel du 2-propénamide (ou encoure amide
acrylique) de formule brute C3H5NO. En biologie moléculaire, on utilise
l’acrylamide polymérisé (polyacrylamide) pour réaliser des
électrophorèses en position verticale utilisée surtout dans la méthode
de séquençage de l’ADN; ce gel sert à la séparation des petits
fragments. Afin de préparer le gel de polyacrylamide, les chaines
d’acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) sont pontées avec la bisacrylamide
(CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) suite à une polymérisation par
le persulfate d’ammonium ; cette réaction est initiée à l’aide de TEMED
(tétraméthyléthyléne diamine qui réagit avec la lumière ce qui donne
des ions hyper actifs). La porosité du gel dépend de la concentration
d’acrylamide et de bisacrylamide et du rapport
Acrylamide/Bisacrylamide.
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Ultracentrifugation
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Lecture de l’électrophorèse
La révélation des bandes est faite par autoradiographie. Le brin est
directement lue en partant des plus petits fragments (près de l’extrémité
5’) vers les plus longs (près de l’extrémité 3’) c’est-à-dire que la
comparaison des puits G, AG, CT et C est faite dans un ordre de distance de
migration décroissant (du bas en haut).
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G/A+G/T+C/C
Cathode (–) 3’
Anode (+) 5’
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Préparation de l’ADN
Découpage et isolement du fragment d’ADN à séquencer
Séparation des brins
Préparation de l’amorce
Hybridation/élongation
On réalises des copies du monobrin à séquencer par une PCR, ces copies sont ensuite
séparées en quatre tubes contenant chacun, le monobrin à séquencer et son amorce,
une ADN polymérase et les quatre désoxyribonucléotides dNTP (dCTP, dATP,dTTP et
dGTP). Ensuite, dans chaque préparation (tube), on met de petites quantités d’un
didésoxyribonucléotide (ddNTP). Ces derniers sont marqués radioactivement.
Séparation des fragments par électrophorèse
Lecture de l’électrophorèse
La révélation des séquences synthétisées dans les quatre tubes se fait par
autoradiographie. L’enchainement nucléotidique lu à partir du gel représente la
séquence d’ADN synthétisée à partir de la séquence initiale à séquencer pour
déterminer la séquence initiale il suffit d’estimer la séquence complémentaire(Figure
12).
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Amorce
Anode +
Sens de migration
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