Biologie

moléculaire
L'acide désoxyribonucléique (ADN) est une
molécule, présente dans toutes les cellules vivantes,
qui renferment l'ensemble des informations
nécessaires au développement et au
fonctionnement d'un organisme. C'est la molécule
de l'hérédité car il est transmis lors de la
reproduction, de manière intégrale ou non. Il porte
donc l'information génétique et constitue le
génome des êtres vivants du plus simple au plus
complexe.
L’objectif de ces travaux pratiques est
de permettre aux étudiants d’observer
de manière concrète à quoi ressemble
de l'ADN, plutôt que de se baser
uniquement sur l’observation de
modèles moléculaires théoriques. Ainsi
que l’application de certaines
techniques d’analyse de la molécule
d’ADN comme l’électrophorèse et le
dosage par absorption à UV
TRAVAUX PRATIQUES DE
BIOLOGIE MOLECULAIRE
 Echantillon

Récupération de l’ADN Lysat

.

Schéma récapitulatif du principe de

l’extraction

Dégitions des
Précipitation par l’éthanol
protéines (protéinase)

Extraction (acetate de
potassium)
les différents types de matériels biologiques qu'on peut
utiliser pour extraire la molécule d'ADN :

3.
1. Sang 2. Salive 4. Tissus
Cheveux
les différents
Méthode Phénol- Méthode d'Extraction à
techniques qu'on Chloroforme l'Isoamyle Alcool
peut utiliser pour
extraire l'ADN;
comme solvent Extraction au SDS
(Dodecyl Sulfate de
Méthode
Detergent/Protéinase K
organique phénol Sodium)

chloroforme :
Extraction au SDS-
Méthode Salting Out
Chloroforme
 Lyse cellulaire

- salive L'eau stérile 100ul de l'eau

surnageant 25ul SDS

centrifugation 10min à verser le surnageant et

4000rpm culot garder le culot

Laisser reposer
5 min

15 ul
220µl d’acétate de protéinase K
potassium

centrifugation 50min à
12000 rpm à 4°C Incuber à 55°C
verser le surnageant dans un pendant 2h
tube eppendorf 1,5 ml et
éliminer le culot
 Précipitation de l’ADN à
.
l’aide d’alcool
- Ajouter un volume d’isopropanol refroidi égal au
volume de surnageant et mélanger doucement en
inversant plusieurs fois le tube. Placer le tube à -
20°C pour 10 minutes.
- Centrifuger pendant 10 minutes à 12000 rpm.
- Rincer le culot avec 300 µl d’éthanol 70% refroidi.
- Centrifugez à 12000 rpm pendant 5 minutes jeter
le surnageant, égoutter et laissez sécher le culot à
l’air libre.
- Reprendre le culot avec 20 µl d’eau ultra pure
stérile.
- Conserver l’ADN en solution à 4°C pour une
courte durée
 Q&R
1- Que signifie TBE 1X ?
TBE : tampon Tris-Borate-EDTA concentré 1 fois. Car on le prépare
cencentré 10fois (10X) et on le dilue avant utilisation
2- Comment estimer la quantité d’ADN ?
L’estimation de la concentration d’ADN est réalisée par comparaison
de l’intensité de fluorescence et épaisseur de la bande d’un ADN
témoin dont la quantité déposée est connue. On estime la quantité de
l’ADN échantillon par comparaison à la quantité du témoin (en ng) et
on ramène à la concentration (ng/ul) selon le volume déposé
3- Pourquoi on ajoute l'ethanol 70% refroidi ?
L’éthanol 70% permet le lavage de l’ADN extrait. Refroidi pour
augmenter la récupération de l’ADN précipité
4- Quelle sont les différences entre Méthode saline et Méthode phenol-
chloroforme ?
Méthode phénol-chloroforme : méthode de référence utilisant un
solvant organique Méthode saline : utilisant un solvant inorganique
5- Le rôle de tampon TBE ?
Tampon : sert à préparer le gel d’agarose et de tampon de
migration au cours de l’électrophorèse
6- C'est quoi le rôle d’isopropanol et d’acétate de potassium
L’isopropanol est un alcool qui permet de précipiter les
molécules d’ADN. L’acétate de potassium joue le même rôle
que le phénol-chloroforme c’est-à-dire la séparation des
acides nucléiques des protéines
7- Pourquoi on ajoute SDS à 20% de concentration
La lyse cellulaire peut être réalisée de différentes façons
(chimique, enzymatique, mécanique…). En TP, la lyse est
chimique utilisant le SDS (sodium dodécyl sulfate 20%). Le
pourcentage est optimisé de façon à lyser la cellule sans
abimer les composants intracellulaires.
 Q&R
8- Quelle est la différence entre la méthode 1 du Tp
avec le protocole de référence ?
Voir réponse à la question 4
9- Est-ce que le bromure d éthidium est utilisé pour
détecter les fragments d’ADN sur le gel d'agarose ?
Le BET permet de révéler la présence des acides
nucléiques (ADN et ARN) grâce à ses 2 propriétés :
il s’intercale spécifiquement entre les bases azotées
et il fluoresce sous UV
10- Quels sont les critères moléculaires exploités
dans la séparation de l’ADN ??
l’ADN eucaryote migre en fonction de la taille et la
charge
11- Qu'elle est la relation entre loi de Beer-Lambert et
l'extraction d'ADN ?
Aucune relation n’existe entre ces 2 points sauf que pour
mesurer la concentration de l’ADN par
spectrophotométrie UV, le calcul de la concentration
utilise la loi de Beer Lambert (Revoir vos cours de
biochimie)
12- Quels sont les paramètres qui influencent la migration
des échantillons ?
Voir réponse à la question 10
13- Pourquoi ajouter l'eau distillée ? Et pourquoi sécher
le culot à l'aire libre?
L’ADN extrait après le dernier lavage est récupéré sous
forme de culot. On laisse sécher pour évaporation
complète de l’alcool. On élue dans l’eau distillée stérile ou
un tampon TE (TrisEDTA) pour obtenir une solution