TP 02 de biologie moléculaire :

L’extraction de l’ADN à partir de sang

totale

Préparé par :
 EL Habchi Yamina
 Bel Hamel Batoule
 Boucharaub choubaila
 Ferrag marwa

Dr : karouche

2023/2024
L’introduction :
L’extraction de l’ADN est une technique
permettant d’isoler l’ADN des cellules ou des
tissus. L’ADN ainsi extrait peut ensuit être
utilisé pour des recherches de biologie
moléculaire, telles que le séquençage, la PCR
ou le clonage .il existe différents protocoles
pour extraire l’ADN, qui suivent
approximativement le même schéma de
principe :
 Lyse des cellules
 Elimination des protéines
 Elimination des autres acide nucléique
(l’ARN)
Le but :
Extraction de l’ADN à partir de sang totale.
Matériels :
 Le sang
 Bicher
 Seringue médicale
 Vortex
 Centrifugation
 Papier filtre
 Bain de marie
 Les glaces
 Sauter
 Les tombons bleu
 Les tube EDTA
 Les solution (A ; B ; C) de la lyse
 Micro pipette
 Tubes de centrifugeuse
 Congélateur à-80c°à-20c°
 Portoirs pour les tubes
 Chloroforme
 Éthanol à 70%
Méthode de travaille :
La lyse de L'ADN se fait à partir des G. Blanc
 Solution A (Ph=8) : Succrosé (0 ,32M)
Tris Hel (2M).
Mg cl(1M), tritox100(1%).
 Solution B(PH+8) : tris Hcl(2M). EDTA
(500mM)
Na cl (5), SDS (20L).
 Solution C : perchlorate de sodium (5M).
 Calcule : 200 ml d'eau distille = 0,2L
Solution A(PH=8)
PM = 342,29 g/ml x Masse molaire 0, 32Mx
(0,02L) =2,19g
Tris Hcl (2M) ; molarité
PM =157,594*2M*0 ,02L=6,303g
MgcL2 :
95,21*1M*0,02L=1,90g
Triton :(1%)
0,2 ml du triton (liquide) dans 20md d'eau
distillée.
Solution B : pH=8
Tris Hcl : 6,303 g.
-EDTA : PM = (292, 242x0,5Mx0,02L)
=2,92g
-Na cl = 58,44x5M*0,02L =5.844g
-SDS (20%)20g*20/100M=4
Solution C= 10 ml
-perchlorate de sodium 5M 122, 44x5x0,012 =
6, 12g.
Protocole :
1/ lyse des GR = sont détruits par choc
hypnotique ménagé, le volume de 15 ml de
sang est ajouté à 40 ml de la Solution
hypotonique A.
 Le mélange est agité délicatement est puis
centrifuger à 3000pm/15mm
 Le culot Blanchette obtenu correspond aux
GB.
  En recouper le culot qui contient les
leucocytes
2/ Lyse des GB :
 Le culot obtenu est suspendu dans un
Volume de 2ml d’une solution B, le
mélange est vortex pendant plusieurs
Secondes pour bien remettre en
suspension.
 Transférer la Suspension dans un tube de
15 ml.
3 /La protéinasion : Les protéines sont
déprotéinisé par
L’action du perchlorate de Sodium (solution
C)
500 ul est ajouté au tube contenant le lysat
puis incuber pendant 30-45 min a 65°c sous
agitation douce.
4/ Extraction d'ADN :
Un Volume de 2 ml de chloroforme (-20°c) est
ajouté à la suspension.
Celle-ci est agitée puis centrifugée à 2000pm/5
minutes.
La phase Supérieure dite aqueuse est
transférée dans un nouveau tube de
centrifugation de 15 ml...
5/ Précipitations d'ADN
 2 Volume d'Ethanol absolu conservé à
20°C Sont ajoutes.
 Les tubes sont agités doucement par
retournement jusqu’ a la formation de la
méduse d’ADN.
 La méduse est récupérée dans un tube
appendre contenant de l'éthanol a 70%
pour être laver.

Résultat :
la solution Le but résultat
La solution La lyse des
A globules
rouges

La solution La lyse des

B globules
blancs
La solution Séparation
c des
protéiens
LA DO :
260nm=1,23
280nm=1,068
Donc :
1,23/1,068=1,15
Donc l’ADN est contaminé au protéine
La conclusion :
En conclusion, l'extraction de l'ADN à
partir d'une cellule sanguine est une
technique cruciale en biologie moléculaire
qui permet aux chercheurs d'étudier le
génome des individus et de comprendre les
maladies génétiques. Les différentes
méthodes disponibles offrent une grande
flexibilité pour répondre aux besoins des
expériences et des applications spécifiques.