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Les technologies de l’ADN recombinant

2- Méthodologie d’étude
I- Extraction de l’ADN cible :
1- Définition :
L’extraction et la purification des acides nucléiques sont les premières étapes dans la plupart des
études de biologie moléculaire et dans toutes les techniques d’ADN recombinant. L’objectif des
méthodes d’extraction des acides nucléiques dans le cas présent est d’obtenir des acides nucléiques
purifiés, tirés de sources diverses, afin de pouvoir mener une analyse spécifique de détection d’OGM
en utilisant la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). La qualité et la pureté des acides nucléiques
comptent parmi les facteurs les plus critiques pour l’analyse PCR. Afin d’obtenir des acides nucléiques
hautement purifiés exempts de tout contaminant visibles, des méthodes d’extraction adéquates
devraient être appliquées.
2- Méthode :
L’extraction d’acides nucléiques d’un matériau biologique requiert la lyse cellulaire, l’inactivation des
nucléases cellulaires et la séparation de l’acide nucléique souhaité de débris cellulaires. La procédure
de lyse idéale est souvent un compromis de techniques et doit être suffisamment rigoureuse pour
briser le matériau de départ complexe (par exemple, le tissu), mais suffisamment douce pour
préserver l’acide nucléique cible. Les procédures de lyse courantes sont les suivantes :
 Le broyage mécanique (ex. : broyage ou lyse hypotonique).
 le traitement chimique (ex : lyse détergente, agents chaotropiques, réduction des thiols) et la
digestion enzymatique (ex : protéinase K).
La rupture de la membrane et l’inactivation des nucléases intracellulaires peuvent être combinées. À
titre d’exemple, une solution simple peut contenir des détergents pour solubiliser les membranes
cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour inactiver les enzymes intracellulaires. Après la
lyse cellulaire et l’inactivation du nucléase, les débris cellulaires peuvent être aisément retirés par
filtrage ou par précipitation.
3- Échantient :
Dans la plupart des études de routine en médecine, les leucocytes sanguins représentent la source
majeure d'ADN. Les autres sources cellulaires peuvent être des biopsies (biopsie de villosités
choriales...) ou des cultures de cellules (fibroblastes, lignées lymphoblastiques...). La détection de la
présence d'un ou de plusieurs micro-organismes et virus peut se réaliser dans d'autres milieux
biologiques tels que sérum, liquide céphalorachidien, urine, salive, crachat.

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Il est préférable de prélever stérilement le sang frais sur un anticoagulant du type EDTA, qui, de plus,
est un inhibiteur des nucléases. De préférence, l'extraction de l'ADN doit être réalisée sur du sang
frais, voire, en cas d'impossibilité technique, sur du sang stocké au maximum 1-2 j à 25 °C.
4- Principes de la méthode au CTAB : lyse, extraction et précipitation
Les cellules peuvent être lysées en utilisant le détergent ionique cétyltriméthylammonium bromure
(CTAB), qui forme un complexe insoluble avec les acides nucléiques dans un environnement à faible
teneur en sels. Dans ces conditions, les polysaccharides, les composés phénoliques et les autres
contaminants restent dans le liquide surnageant et peuvent être lavés. Le complexe d’ADN est
solubilisé en élevant la concentration en sels et précipité avec de l’éthanol ou de l’isopropanol.
5- Protocole :
A- Lyse de la membrane cellulaire :
La lyse correspond à la désintégration de la membrane d’une cellule biologique par un agent physique,
chimique ou biologique afin de libérer les protéines et/ou les acides nucléiques. Elle permet de
produire des lysats cellulaires.
La première étape de l’extraction d’ADN est la rupture de la cellule et de la membrane nucléaire. À
cette fin, l’échantillon homogénéisé est tout d’abord traité avec le tampon d’extraction contenant de
l’EDTA, du Tris/HCl et du CTAB. Toutes les membranes biologiques ont une structure générale
commune comprenant des molécules de lipide et de protéines maintenues ensemble par des
interactions non covalentes.

Figure 1 : Représentation simplifiée des membranes cellulaires.

Comme le montre la Figure 1, les molécules de lipides sont agencées sous forme de double couche
continue dans laquelle les molécules de protéine sont « dissoutes ». Les extrémités des molécules de
lipides se composent de « têtes » hydrophiles et de « queues » hydrophobes. Dans la méthode au
CTAB, la lyse de la membrane est accomplie par le détergent (CTAB) contenu dans le tampon
d’extraction. Comme la composition des lipides et celle du détergent sont semblables, le composant
CTAB du tampon d’extraction a pour fonction de piéger les lipides qui constituent la cellule et la
membrane nucléique. Le mécanisme de solubilisation des lipides en utilisant un détergent est illustré
dans la Figure 2.

Figure 2 : Solubilisation des lipides.

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La Figure 3 montre comment le détergent piège les lipides et les protéines, autorisant ainsi la
libération de l’ADN génomique, lorsque la membrane cellulaire est exposée au tampon d’extraction au
CTAB. Dans une concentration salique (NaCl) spécifique, le détergent forme un complexe insoluble
avec les acides nucléiques.
L’EDTA est un composant de chélation qui lie le magnésium, entre autres métaux. Le magnésium est un
cofacteur pour la DNAse. En liant le Mg à l’EDTA, l’activité de la DNAse présente est diminuée. La
combinaison Tris/HCl donne à la solution une capacité d’atténuation du pH (un pH faible ou un pH élevé
endommage l’ADN). Il est important de souligner qu’étant donné le risque de dégradation aisée des
acides nucléiques à ce stade de la purification, le temps écoulé entre l’homogénéisation de
l’échantillon et l’ajout de la solution tampon au CTAB devrait être limité. La purification de l’ADN est
réalisée dès que la cellule et les membranes de l’organelle (comme celles qui entourent les
mitochondries et les chloroplastes) sont séparées.

Figure 3 : rupture de la membrane cellulaire et extraction de l’ADN génomique.

B- Extraction :
Dans cette phase, les polysaccharides, les composés phénoliques, les protéines et les autres lysats
cellulaires dissous dans la solution aqueuse sont séparés du complexe acide nucléique / CTAB.
L’élimination des polysaccharides, ainsi que des composés phénoliques est particulièrement
importante en raison de leur capacité à inhiber un grand nombre de réactions enzymatiques. Dans une
concentration à faible teneur en sels (< 0,5 M NaCl), les contaminants du complexe d’acide nucléique
ne précipitent pas et peuvent être enlevés par l’extraction hors de la solution aqueuse au moyen de
chloroforme. Ce dernier dénature les protéines et facilite la séparation des phases aqueuses et
organiques. Normalement, la phase aqueuse constitue la phase supérieure. Mais si la phase aqueuse
est dense, en raison de sa concentration en sels (> 0,5 M), elle constituera la phase inférieure.
L’acide nucléique aura, en outre, tendance à se dissoudre dans la phase organique si le pH de la
solution aqueuse n’a pas été équilibré comme il se doit à une valeur de pH comprise entre 7,8 et 8,0.
Au besoin, l’extraction au chloroforme est répété deux ou trois fois afin d’enlever complètement les
impuretés de la couche aqueuse. Pour parvenir à la meilleure récupération possible de l’acide
nucléique, une rétroextraction de la phase organique peut être réalisée à l’aide d’une solution aqueuse
qui est ajoutée ensuite à l’extrait précédent. Une fois que le complexe d’acide nucléique a été purifié, la
dernière étape de la procédure peut être accomplie. Il s’agit de la précipitation.

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C- Précipitation :
À ce stade final, l’acide nucléique est libéré du détergent. À cette fin, la solution aqueuse est tout
d’abord traitée à l’aide d’une solution de précipitation composée d’un mélange de CTAB et de NaCl à
concentration élevée (> 0,8 M NaCl). Le sel est indispensable à la formation d’un précipité d’acide
nucléique. L’acétate de sodium peut être préféré au NaCl pour sa capacité de tamponnage. Dans ces
conditions, le détergent, qui est plus soluble dans l’alcool que dans l’eau, peut être élué, tandis que
l’acide nucléique précipite. Le traitement successif par 70% d’éthanol permet une purification ou
élution supplémentaire des sels résiduels.
II- Méthodes de séquences :
1- Introduction :
Le séquençage de l’ADN consiste à déterminer la séquence nucléotidique d’un gène ou d’un fragment
de gêne, ce procédé repose sur la synthèse d’un brin d’ADN par une ADN polymérase.
La séquence d’ADN contient l’information nécessaire aux êtres vivants pour survivre et se reproduire.
La détermination de cette séquence est utile pour les recherches visant à savoir comment vivent les
organismes que pour des sujets appliqués. En médecine, elle peut être utilisée pour identifier,
diagnostiquer et potentiellement trouver des traitements à des maladies génétiques. En biologie,
l'étude des séquences d'ADN est devenue un outil important pour la classification des espèces.
Deux méthodes principales ont d’abord été utilisées : la méthode chimique de Maxam et Gilbert,
aujourd’hui pratiquement abandonnée, et surtout la méthode enzymatique de Sanger aux di
désoxynucléotides qui s’est généralisée en s’adaptant à l’évolution des outils de la génétique
moléculaire.
A- Méthode de Maxam et Gilbert :
1- Définition :
Cette méthode est basée sur une dégradation chimique de l'ADN et utilise les réactivités différentes
des quatre bases A, T, G et C, pour réaliser des coupures sélectives. En reconstituant l'ordre des
coupures, on peut remonter à la séquence des nucléotides de l'ADN correspondant.
Cette technique est basée sur la propriété de certains agents chimiques, l’hydrazine, le diméthyl
sulfate (DMS) et l’acide formique, de modifier les bases de l’ADN. Dans un second temps, la
pipéridine est ajoutée et « casse » les brins d’ADN au niveau des bases modifiées.
2- Procédure :
a- Séparation de brins :
Dénaturation d’un ADN double brin en simple brin en augmentant la température permettre la rupture
des liaisons hydrogène entre les bases nucléiques des deux chaînes complémentaires de l'ADN pour
obtention d’un ADN simple brin.

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Figure 04 : Dénaturation des brins d’ADN

b- Marquage :
Marquage radioactif d’une extrémité 5 'du fragment d'ADN à séquencer par le phosphore radioactif
(P32).

Figure 05 : Marquage de L’ADN

c- Modifications chimiques spécifiques :
Clivage du brin d'ADN à des positions spécifiques en utilisant des réactions chimiques : Cette technique
est basée sur la propriété de certains agents chimiques : l’hydrazine, le diméthyle sulfate (DMS) et
l’acide formique, de modifier les bases de l’ADN.
 Le DMS agit au niveau des bases «G».
 L’acide formique agit au niveau des bases «A+G».
 L’hydrazine agit au niveau des bases «C+T» (en milieu alcalin, l’hydrazine agit uniquement au
niveau des « C »).
d- Coupure :
Après ces réactions, l'ADN est clivé au niveau de la modification par réaction avec une base, la
pipéridine.

Figure 06 : Altération de l’ADN par l’hydralazine.

Obtention de plusieurs brins d'ADN de tailles différentes dans quatre tubes de réaction.

Figure 07 : Brins d’ADN de tailles différentes dans les quatre tubes.

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e- Isolement du fragment d'ADN à séquencer :

Les fragments sont soumis à une électrophorèse dans des gels d'acrylamide à haute résolution pour
la séparation des tailles. Ces gels sont placés sous un film radiographique qui donne une série de
bandes foncées et montrent l'emplacement des molécules d'ADN radiomarquées. Les fragments sont
classés par taille et nous pouvons donc déduire la séquence de la molécule d'ADN dans le sens 5’➔3’
du bas en haut.

Figure 08 : Autoradiogramme après traitement chimique des fragments

B- Méthode de Sanger :
1- Définition :
La méthode des didésoxyribonucléotides, inventée par Fred Sanger, est employée pour séquencer
l’ADN. Elle repose sur l’allongement par l’ADN polymérase d’un brin à partir d’une amorce, en utilisant
un autre brin d’ADN comme matrice. Cet allongement est réalisé en présence des quatre
désoxyribonucléotides triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), monomères utilisés par la
polymérase, et d’un analogue didésoxyribonucléotide (ddNTP), qui joue le rôle de terminateur de
chaîne. Du fait de l’incorporation spécifique de l’analogue par la polymérase, on obtient un mélange de
fragments qui se terminent sélectivement aux positions correspondant au nucléotide choisi.
2- Principe :
On effectue ainsi quatre réactions en parallèle, chacune avec l’un des quatre ddNTP, et l’on sépare les
fragments obtenus par électrophorèse. Afin de pouvoir identifier les fragments d’ADN synthétisés par
la polymérase et en particulier pour pouvoir les distinguer de l’ADN matrice, on les marque avec un
traceur fluorescent. Celui-ci est accroché à l’une de ses deux extrémités, soit en 5’, sur l’amorce de
séquençage, soit en 3’ sur le didésoxyribonucléotide terminateur.

Figure 09 : Principe du séquençage par la méthode de Sanger

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Les séquenceurs automatiques modernes utilisent un système de détection in situ pendant

l’électrophorèse. Le faisceau d’un laser émettant dans la bande d’absorption du fluorophore traverse
le gel.

Figure 10 : Séquençage automatique sur des séquenceurs 1 et 4 fluorophores.

Pendant la migration, lorsqu’une bande d’ADN passe devant le faisceau, un signal de fluorescence est
émis. Celui-ci est capté par une photodiode située en regard du gel. Le signal est amplifié puis
transmis à l’ordinateur de contrôle et analysé par un logiciel spécialisé. Dans des conditions
favorables, cette technique permet de lire jusqu’à 1000 nucléotides par fragment séquencé. En
routine, la moyenne est de l’ordre 500 à 800 nucléotides par expérience.
III- Principales techniques d’hybridation moléculaire :
1- Introduction :
L’hybridation moléculaire repose sur le principe qu’un fragment ADN simple brin s’apparie à un autre
fragment ADN en respectant rigoureusement les règles de complémentarité. L’hybridation est réalisée
entre une sonde dont la séquence est connue et un segment ADN monobrin obtenu après dénaturation.
En fait n’importe quelle paire de deux molécules simple brin d’acide nucléique double brin est capable
de former une molécule double brin aussi longue que leurs bases sont majoritairement
complémentaires. La molécule double brin est appelée un hybride. Des hybrides peuvent se former
ente deux brins d’ADN, entre un brin d’ADN et un brin d’ARN ou entre deux brins d’ARN.
Cette propriété des acides nucléiques est utilisée dans une série de techniques analytique dans
lesquelles un ADN ou un ARN spécifique au sein d’un mélange complexe est détecté grâce à un acide
aminé de séquence complémentaire.

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A- Hybridation sur filtre :

1- Définition :
L’hybridation sur filtre d'une préparation d'acide nucléique dénaturée et immobilisée sur un filtre avec
une solution d'ADN ou d'ARN dénaturé et marqué. Cette hybridation est réalisée par incubation aux
conditions dénaturantes.
• Southern Blot : Cette méthode a été initialement décrite par E.M. SOUTHERN en 1975. Elle
consiste à détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur
hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radio-isotope.
• Northern Blot : Le principe est le même que pour le Southern Blot mais ici ce sont les ARN
qui sont étudies. plus besoin de digérer par enzyme de restriction.
• La visualisation d'un ARN par une sonde permet :
 apprécier sa distribution dans les tissus, étudier son abondance relative
 déterminer sa taille.

2- Principe :
Southern décrivit la méthode consistant à détecter très spécifiquement des fragments d'ADN
transférés sur filtre par leur hybridation à des séquences identiques radioactives.
L'ADN purifié de cellules quelconques, par exemple de leucocytes circulants, est coupé en des sites
très spécifiques par des enzymes de restriction qui reconnaissent des séquences nucléotidiques
bien particulières, dispersées au hasard sur l’ADN. Une très grande variété de fragments est ainsi
produite, dont l'un (ou un tout petit nombre) correspond à une partie ou à la totalité du gène étudié.
Les fragments sont séparés selon leur taille par électrophorèse dans un gel d'agarose, puis
dénaturés par un traitement alcalin : le gel est immergé dans une solution de soude qui sépare les
deux brins d'ADN de chaque fragment. Les fragments, maintenant simples brins, sont transférés par
capillarité sur un filtre de nitrocellulose. Le filtre est alors incubé dans des conditions bien
déterminées avec des petits fragments d'ADN (ou parfois d'ARN), eux aussi dénaturés, de séquence
identique à celle d'une partie du fragment recherché ; ces fragments radioactifs sont appelés
«sonde». Les bases complémentaires forment alors des hybrides stables qui persistent après
lavages répétés du filtre pour éliminer toute trace de sonde radioactive non spécifiquement liée à une
séquence complémentaire.
Le ou les fragments correspondant au gène ou aux séquences intergéniques étudiés apparaît alors .en
autoradiographie sous la forme d'une bande radioactive dont la position dépend de la taille du
fragment qui migre d'autant plus vite qu'il est plus petit.

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Figure 10 : Le principe de la technique d’hybridation sur filtre.

B- Hybridation in situ :
1- Définition :
On appelle hybridation in situ (HIS) l'utilisation de sondes d'acides nucléiques pour mettre en évidence
et localiser, dans des cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques, complémentaires de
la sonde par leurs bases. L'HIS est un outil incomparable pour étudier l'expression des gènes.
Elle repose sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique (ADN ou ARN) marquée avec une séquence
complémentaire d'acides nucléiques que l'on cherche à identifier et à localiser. L'HIS s'effectue sur
une coupe histologique de tissu, apportant ainsi des informations précises sur la localisation des
acides nucléiques étudiés.
Les sondes utilisées sont le plus souvent de l'ADN (double brin ou plus rarement monobrin) ou un
ARN-messager ou des oligonucléotides synthétiques. Le marquage des sondes peut être réalisé par
des isotopes radioactifs ou soit fluorescents (FISH) soit non-fluorescents comme la biotine.
En fonction de marquage de la sonde on distingue :

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2- Principe de l’Hybridation In Situ (HIS) :

Le principe de la technique est intrinsèquement simple : il s’agit d’utiliser des sondes d’acides
nucléiques de séquences connues et marquées, capables de s’apparier dans des conditions
spécifiques à des séquences cibles d’ADN ou ARN complémentaires pour former une molécule hybride.
L’HIS se révèle donc être un outil essentiel en biologie cellulaire, en génétique et en pathologie pour la
détection et la localisation de séquences d’acides nucléiques spécifiques. Cette possibilité de
visualiser directement la répartition spatiale de séquences spécifiques fournit des informations
cruciales pour comprendre l’organisation et la fonction des gènes.
Cette méthode nécessite une grande rigueur technique et sa sensibilité dépend de nombreuses
variables :
 Méthode de préparation histologique pour optimiser la rétention de la cible, ADN ou ARN, dans
le tissu et l’accès à la cible.
 Conception de la sonde (type de sonde et type de marquage) et méthode de détection des
hybrides.
 Conditions d’hybridation et ses effets sur la formation des hybrides.

Figure 11 : Le principe de la technique d’hybridation in situ.

C- Hybridation en solution :
1- Définition :
L’hybridation en phase liquide repose sur la formation d’hybrides ADN/ARN capturés sur des
microplaques recouvertes d’anticorps spécifiques. Une amplification du signal est ensuite réalisée à
l’aide d’anticorps couplés à la phosphatase alcaline. La détection de la réaction est effectuée par
chimiluminescence.

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2- Principe :
Il s’agit d’une hybridation en solution utilisant des sondes d’ARN reconnaissant plusieurs types de virus.
L’ADN des cellules est dénaturé au contact de la soude, puis hybridé avec un mélange de sondes d’ARN
spécifiques pour donner des molécules hybrides ADN/ARN. Ces derniers sont transférés dans une
microplaque et sont reconnus par des anticorps spécifiques et la révélation se fait par
chimioluminescence.
La radiation lumineuse qui est émise est mesurée en unités RLU (Relative Light Unit). Une intensité RLU
égale ou supérieure à la valeur du seuil critique indique la présence de séquences d’ADN viral dans
l’échantillon.

Figure 12 : Principe d’hybridation en solution.

IV- Techniques d’amplification :

1- Introduction :
Amplification génétique est une technique de biologie moléculaire permettant par multiplication
sélective d'un fragment d'ADN de dépister de très petites quantités de microorganismes. En dehors de
son intérêt diagnostique, l'amplification génique permet de quantifier la charge virale : intérêt en
particulier dans le traitement des infections virales et au cours des hépatites virales.
Ces techniques sont basées sur la répétition de réplication in vitro de l’ADN à partir d’amorces
spécifiques. La plus connus d’entre elle est l’amplification en chaîne par polymérase ou PCR
(polymerase chain reaction) qui a complétement bouleversé les stratégies utilisées en biologie
moléculaire.

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a- Amplification en chaîne par polymérase ou PCR :

1- Définition :
La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un
acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. Pour se
faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en
boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de
matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle. La technique est automatisable,
elle est d’une très grande sensibilité. La révélation du produit amplifié se fait généralement par
migration électrophorétique sur gel.
2- Principe :
Le principe consiste à amplifier un fragment d'ADN ou d’ARN servant de matrice, obtenu après
extraction à partir de prélèvements de nature diverses (sang, biopsies, liquide céphalo-rachidien…),
délimité par des amorces spécifiques (ou primer). Celles-ci sont constituées d'un segment d’environ
20 paires de bases. Leur association à l'ADN cible est suivie d'une élongation par la Taq-polymérase,
aboutissant à la synthèse d'un ADN double brin de longueur habituelle d’environ 1000 Paire de base.
Cette amplification est répétée un certain nombre de fois afin d'obtenir une quantité d'ADN suffisante
pour être détectée et analysée.
3- Protocole :
On ajoute dans un tube de l'ADN qui sert de matrice, deux oligonucléotides hybridant sur chacun des
deux brins de l'ADN, une polymérase thermostable et les 4 desoxynucléotides triphosphates. On
chauffe le tube à 95°C, les deux brins d'ADN se séparent. On abaisse la température en dessous du Tm
des deux oligonucléotides, ils s'hybrident à l'ADN.
L'hybridation est concentration dépendante, comme la concentration des deux oligonucléotides est
beaucoup plus élevée que la concentration de l'ADN, l'hybridation des oligonucléotides aura lieu alors
que l'hybridation de l'ADN n'aura pas le temps de se faire. On élève ensuite la température à 72°C,
température de fonctionnement de l’ADN polymérase.
L’ADN néoformé peut servir de matrice pour un nouveau cycle, si on répète cette alternance de
température une quarantaine de fois, la région située entre les deux oligonucléotides présente en une
seule copie au début de l'expérience se retrouvera en 240 soit 1012 copies à la fin de l'expérience.
Comme la polymérisation a toujours lieu de 5' vers 3', les brins matrices issus de la polymérisation
sont bornés en 5' et en 3' par les oligonucléotides (en 3') ou leurs séquences complémentaires (en 5').
On obtiendra donc un fragment d'ADN de longueur égale à la distance les séparant et à laquelle il faut
ajouter à taille des deux oligonucléotides qui font partie du produit amplifié. Les fragments non bornés,
provenant de la polymérisation sur l'ADN de départ n'ont pas une croissance exponentielle mais
linéaire, (2 x 40) et leur quantité sera rapidement négligeable au cours des cycles successifs.

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Figure 13 : Principales étapes d’analyse d’un échantillon par PCR

Figure 14 : Le Principe de PCR qualitatif.

V- Variantes de la PCR :
a- La PCR nichée (nested PCR) :
C’est une succession de réactions PCR effectuées afin d’amplifier spécifiquement une séquence, en
réalisant deux PCR successives dont le produit issu de la première PCR est de nouveau amplifié au
cours de la deuxième. L’intérêt majeur de cette deuxième amplification est d’augmenter la spécificité
de cette technique.
Deux couples d'amorces différents sont successivement utilisés dans cette technique :
 un couple d'amorces externes qui permettent en premier lieu l’amplification d’un fragment
d'ADN cible, selon la méthode classique de la PCR.

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Les fragments d'ADN obtenus servent alors de matrice pour une seconde PCR.
 un couple d'amorces internes qui servent à délimiter la région interne (ou nichée) du
fragment nucléotidique issu de la première amplification avec le premier couple d'amorces, et
donnera des fragments de taille inférieure à ceux obtenus avec la première amplification.
Les résultats de cette PCR doivent être interprétée avec précaution dans la mesure où cette méthode
associe deux PCR classiques successives et permet certes d'augmenter la spécificité ; cependant elle
est difficilement utilisable pour un usage de routine sur des grandes séries car elle nécessite
beaucoup de temps de manipulation et présente d’énormes risques de contaminations.

Figure 15 : Principe de la PCR Nichée (Nested PCR)

b- La PCR multiplex :
Cette variante de la PCR s’intéresse à l’amplification d’ADN de différentes origines (issu de plusieurs
échantillons) dans un seul et même tube. Sa réalisation exige l’utilisation de plusieurs couples
d’amorces avec des températures d’hybridation et des longueurs des produits amplifiés semblables
ainsi que l’utilisation de la Taq polymérase. La PCR multiplex a pu régler en quelque sorte les
problèmes de contamination de la PCR classique, mais cela ne l’a pas empêché d’en poser d’autres. En
effet, elle favorise la formation de produits PCR non spécifiques tels que les dimères d’amorce. Cette
technique peut également favoriser l’amplification de courts fragments d’ADN par rapport aux longs
d’où les différences de rendement. Les produits de la PCR multiplex peuvent subir une hybridation
supplémentaire avec une sonde spécifique du gène pour vérification.

Figure 16 : PCR multiplex.

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c- La RT-PCR :
L’amplification in vitro ne concerne pas seulement l’ADN, l’ARN peut également faire l’objet
d’amplification. Cette dernière est désormais possible grâce à une réaction appelée la RT-PCR, pour
Reverse-transcriptase PCR, une technique permettant de réaliser une amplification à partir d’ARN.
Ce dernier doit passer par une étape préliminaire de transcription inverse au cours de laquelle l’ARN
sera transformé (transcrit) à partir d’une amorce en ADN complémentaire noté ADNc grâce à une
enzyme recombinante ADN polymérase ARN dépendante, également appelée transciptase inverse.
Dans un second temps, l’ADNc synthétisé est amplifié par PCR classique.
Si la technique de la RT-PCR ne présente pas de difficulté technique particulière, elle est, cependant,
rendue délicate par le caractère extrêmement labile de l’ARN, ainsi que la contamination possible des
échantillons d’ARN par de l’ADN, ce qui impose de prendre un certain nombre de précautions dans la
réalisation de l’analyse, surtout lorsque l’on souhaite l’utiliser pour le diagnostic clinique.
1- Les éléments réactionnels de la RT PCR :
L’ARN matrice
Deux types d’ARN matrice peuvent être utilisés en RT-PCR : l’ARN total ou les ARN messagers isolés :
1- L’ARN total :
L’ARN total est le mélange de tous les types d’ARN qui se trouvent dans la cellule : les ARN messagers
(3 à 5 % seulement de l’ARN Total), les ARN de transfert (ARNt), et les ARN ribosomiaux (ARNr). Il faut
noter aussi que la réaction de RT-PCR est limitée lorsqu’elle est réalisée à partir d’ARN total suite à
l’inhibition de la RT par les ARNt, ce qui peut poser problème en cas de cible très minoritaire.
2- Les ARN messagers :
L’obtention de l’ARNm se fait soit par extraction directe soit par passage de l’échantillon sur une
résine contenant des groupements polyT. Cette méthode permet d’augmenter la sensibilité de
l’analyse et éviter la contamination de l’échantillon par de l’ADN. Elle présente également quelques
inconvénients car nécessite un matériel couteux et une pratique complexe pour un rendement
relativement faible suite à l’élimination des ARNm dépourvus de polyA et partiellement dégradés.
L’enzyme : la transcriptase inverse
La majorité des RT commercialisées sont des RT recombinantes pour leur facilité de production
industrielle ainsi que pour la possibilité de sélectionner des clones ayant des mutations qui diminuent
leur activité enzymatique.
Propriétés de la Transcriptase reverse :

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Dépourvue d’activité RNAseH (RNAseH-) : elle dégrade le brin d’ARN au niveau des hétéroduplex
ARN/ADN formés avec les amorces ou le brin d’ADNc en cours de synthèse
Température élevée (> 42 °C et certaines peuvent attendre les 72°C) : cette température favorise la
rétro transcription des séquences contenant des structures secondaires (cas de l’ARN viral).
Haute affinité pour l’ARN : le substrat, dans ce cas l’ARN, doit présenter une affinité pour l’enzyme, de
ce fait le choix est orienté vers des RT isolées à partir de virus car elles auraient une affinité
supérieure par rapport aux autres RT.
Les amorces :
Amorces aléatoires :
Ce sont des séquences de 6 ou 8 nucléotides (généralement hexamère mais les hectomètres sont
utilisés dans le cas de rétro transcription à température élevée) synthétisées aléatoirement. Ces
amorces se fixent sur les ARN matrices présents de façon aléatoire.
Vue la polyvalence que confère ce type d’amorçage, il est largement utilisé pour synthétiser l’ADNc à
partir d’ARNm fragmentés, d’ARN riches en structures secondaires, et dans l’amplification de
plusieurs cibles à partir de la même préparation d’ADNc. La concentration des amorces aléatoires
dépend de la longueur du brin synthétisé, car cette dernière est inversement proportionnelle à la
concentration des amorces.
Les inhibiteurs de RNAses :
Pour protéger l’ARN de la dégradation, des inhibiteurs des enzymes RNases sont commercialisés et
dont la composition est souvent inconnue, ce qui rend le choix plutôt difficile.
Mélange de désoxynucléotides (dNTP) :
C’est le mélange de 4 types de nucléotides, dATP, dTTP, dCTP, dGTP (similaire à la PCR classique)

Figure 17 : Principe de la RT-PCR

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