Parti 2

Licence Professionnelle
Filière: Biotechnologie Agroalimentaire (BA)
Semestre 5
Module : Biologie Moléculaire

Partie 2: Les techniques de base de la Biologie moléculaire
PAR: Dr. Nadia LAMSAADI
Hay Tighnari, Route nationale N11 de Casablanca commune de Fkih Ben Salah, Boite Postale 336
Module : Biologie Moléculaire
Les techniques de base de la Biologie moléculaire

• Purification des acides nucléiques
• Migration électrophorétique des fragments d’ADN
Partie 2
• La technique d’amplification génique ou technique PCR
• La RT‐PCR
• Le séquençage de l’ADN
1) Extraction et purification des acides nucléiques
 L’extraction et la purification des acides nucléiques et plus précisément

d’ADN sont les premières étapes dans la plupart des études de biologie
moléculaire et dans toutes les techniques d’ADN recombinant. Afin d’obtenir
des molécules d’ADN hautement purifiés exempts de tout contaminant
visibles, des méthodes d’extraction adéquates devraient être appliquées.
 Vu qu’il existe une grande diversité de méthodes d’extraction et de purification des ADN, le choix de la technique
la plus adéquate repose généralement sur les critères suivants :
• L’organisme source,
• Le matériel de départ (tissu, feuille, graine, matériel transformé, etc.),
• Les résultats escomptés (rendement, pureté, temps de purification requis, etc.),
• L’application en aval (PCR, clonage, étiquetage, transfert d’ADN, RT-PCR, synthèse d’ADNc, etc.)
Méthodes d’extraction et de purification d’ADN chromosomique
 L’extraction d’ADN chromosomique d’un matériel biologique requiert la lyse cellulaire, l’inactivation des nucléases cellulaires
et la séparation de l’ADN chromosomique des débris cellulaires. La procédure de lyse idéale est souvent un compromis de
techniques et doit être suffisamment rigoureuse pour briser le matériau de départ complexe (par exemple, le tissu), mais
suffisamment douce pour préserver l’acide nucléique cible.
 Lyse cellulaire ou rupture de la membrane : Les procédures de lyse courantes sont accomplies par des méthodes physiques
(ex. : broyage ou lyse hypotonique), des méthodes chimique (ex.: lyse détergente, agents chaotropiques, réduction des thiols)
et la digestion enzymatique (ex.: protéinase K).
 La rupture de la membrane et l’inactivation des nucléases intracellulaires peuvent être combinées. À titre d’exemple, une
solution simple peut contenir des détergents pour solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants
pour inactiver les enzymes intracellulaires. Après la lyse cellulaire et l’inactivation du nucléase, les débris cellulaires peuvent
être aisément retirés par filtrage ou par précipitation.
Méthodes d’extraction et de purification d’ADN chromosomique
 Élimination des lipides : L’élimination ou la séparation des lipides membranaires et des débris cellulaires se
fait généralement à l’aide de détergents comme le sodium dodecyl sulfate (SDS) et par centrifugation.
 Élimination des protéines de l’extrait cellulaire : La dénaturation

des protéines est effectuée à l’aide d’une protéase telle que la pronase ou la
protéinase K. Après quoi, les protéines dénaturées sont séparées de l’extrait
cellulaire.
 Élimination de l’ARN : l’ARN est éliminé par addition de RNase qui le

dégrade rapidement en ribonucléotides.
 Précipitation/agrégation/élution de l’ADN : la molécule d’ADN est

précipitée par l’ajout de l’alcool éthylique absolu permettant la formation
d’une pelote blanchâtre (Méduse)
Extraction et purification de l’ADN génomique chez les eucaryotes
A partir d'extraits végétaux
 Parmi les procédés les plus utilisés, Méthode d’extraction et de purification au CTAB (cétyltriméthyl ammonium
bromure). Etabli pour la première fois par Murray et Thompson en 1980 (Murray et Thompson, 1980),
 Cette méthode convient pour la suppression des polysaccharides et des

composés polyphénoliques qui affectent la pureté de l’ADN et donc la
qualité. Le principe de la méthode repose sur trois étapes lyse,
extraction et précipitation.
 Des cellules végétales peuvent être lysées en utilisant le détergent

ionique cétyltriméthyl ammonium bromure (CTAB), qui forme un
complexe insoluble avec les acides nucléiques dans un environnement à
faible teneur en sels. Dans ces conditions, les polysaccharides, les
composés phénoliques et les autres contaminants restent dans le
liquide surnageant et peuvent être lavés. Le complexe d’ADN est
solubilisé en élevant la concentration en sels et précipité avec de
l’éthanol ou de l’isopropanol.
Méthode d’extraction et de purification au CTAB
1) Lyse de la membrane cellulaire: la première étape de l’extraction d’ADN est la rupture de la cellule et de la membrane
nucléaire. À cette fin, l’échantillon homogénéisé est tout d’abord traité avec le tampon d’extraction contenant de l’EDTA, du
Tris/HCl et du CTAB.
Dans la méthode au CTAB, la lyse de la membrane est accomplie par le détergent

(CTAB) contenu dans le tampon d’extraction. Comme la composition des lipides et
celle du détergent sont semblables, le composant CTAB du tampon d’extraction a
pour fonction de piéger les lipides qui constituent la cellule et la membrane
nucléique.
Dans une concentration

Le détergent (CTAP) a piégé salique (NaCl) spécifique, le
les lipides et les protéines, détergent forme un
autorisant ainsi la libération complexe insoluble avec les
de l’ADN génomique acides nucléiques
 L’EDTA est un composant de chélation qui lie le magnésium (un cofacteur pour la DNAse), entre autres métaux.
En liant le Mg à l’EDTA, l’activité de la DNAse présente est diminuée.
 Tris/HCl donne à la solution une capacité d’atténuation du pH (un pH faible ou un pH élevé endommage l’ADN).
Remarque: La purification de l’ADN est réalisée dès que la cellule et les membranes de l’organelle (comme celles
qui entourent les mitochondries et les chloroplastes) sont séparées. Pour éviter la dégradation aisée des acides
nucléiques à ce stade de la purification, le temps écoulé entre l’homogénéisation de l’échantillon et l’ajout de la
solution tampon au CTAB devrait être limité.
L’extraction : dans cette phase, les polysaccharides, les composés phénoliques, les protéines et les autres lysats cellulaires
dissous dans la solution aqueuse sont séparés du complexe acide nucléique / CTAB. L’élimination des polysaccharides, ainsi que
des composés phénoliques est particulièrement importante en raison de leur capacité à inhiber un grand nombre de réactions
enzymatiques.
 Dans une concentration à faible teneur en sels (< 0,5 M NaCl), les contaminants du complexe d’acide nucléique ne
précipitent pas et peuvent être enlevés par l’extraction hors de la solution aqueuse au moyen de chloroforme.
Dénature les protéines et facilite la

L’acide nucléique aura, en outre, tendance à se dissoudre séparation des phases aqueuses et
dans la phase organique si le pH de la solution aqueuse organiques.
n’a pas été équilibré comme il se doit à une valeur de pH
comprise entre 7,8 et 8,0. Au besoin, l’extraction au Normalement, la phase aqueuse constitue
chloroforme est répété deux ou trois fois afin d’enlever la phase supérieure. Mais si la phase
complètement les impuretés de la couche aqueuse. aqueuse est dense, en raison de sa
concentration en sels (> 0,5 M), elle
constituera la phase inférieure.
Précipitation : à ce stade final, l’ADN génomique est libéré du détergent. À cette fin, la solution aqueuse est tout d’abord
traitée à l’aide d’une solution de précipitation composée d’un mélange de CTAB et de NaCl à concentration élevée (> 0,8 M
NaCl).
 Le sel est indispensable à la formation d’un précipité d’acide nucléique. Dans ces conditions, le détergent, qui est plus
soluble dans l’alcool que dans l’eau, peut être élué, tandis que l’acide nucléique (ADN) précipite.
 L’acétate de sodium peut être préféré au NaCl pour sa capacité de tamponnage.
 Le traitement successif par 70% d’éthanol permet une purification ou élution supplémentaire des sels résiduels
Extraction et purification de l’ADN génomique chez les procaryotes
 L’objectif de la méthode est de purifier l'ADN génomique de source procaryote

tel que d'E. coli. Les cellules sont d'abord concentrées après centrifugation puis
lysées.
 une extraction au phénol ce qui permet de se débarrasser des protéines

cellulaires.
 Les molécules d'ARN sont éliminées par des RNase. Pour concentrer l'ADN, la
méthode utilisée est la précipitation à l'éthanol.
1) Lyse cellulaire et dénaturation des protéines
 Dans un tube à centrifuger en polypropylène, 3mL de culture d'E. coli sont introduit puis
Centrifugé 5 minutes à 150 g, le culot est dissolu dans 2,5 mL de tampon S.E (saline-EDTA,
pH=8). Une solution de lysozyme de 0,15 mL est ajouté et incuber 30 minutes à 37°C puis
ajouter 0,2mL de SDS. Le mélange est incubé 10 minutes à 60°C, puis refroidi dans la glace
jusqu'à température ambiante. 0,60mL de NaCIO4 sont ajouté lentement et mélangé par
agitation douce.
2) Extraction au phénol
Un volume de 3,5mL de phénol saturé est mélangé par retournements successifs pendant 5
minutes de manière à maintenir une émulsion. Le tube est ensuite centrifugé à 16000 x g
pendant 5 min à température ambiante pour séparer la phase aqueuse de la phase
phénolique. La phase aqueuse supérieure, qui contient l'ADN génomique est récupérée dans
un nouveau tube, puis traitée de la même façon avec un mélange phénol/chloroforme.
Après ce dernier traitement la seconde solution aqueuse obtenue est additionné avec 100μg
de RNase par mL, puis le mélange est incubé 15 minutes à 37°C. Une autre extraction par le
mélange phénol/chloroforme est nouvellement appliquée, la phase aqueuse récupérée est
mélangé avec le même volume de chloroforme afin d'éliminer toute trace de phénol. Le
tube est ensuite centrifugé à 16000 x g pendant 5 min à température ambiante pour sépare
la phase aqueuse de la phase organique.
3) Concentration de l'ADN par précipitation à l'éthanol
2,5 volumes d'éthanol à 95% et un volume V d'acétate de sodium à une concentration finale de
0,3 M sont ajouté à un volume de la phase aqueuse, le mélange est incubé 30 minutes à -20°C,
puis centrifugé 15 minutes à 12000 g. Le culot obtenu est lavé par une solution d'éthanol à 70%.
Centrifuger à nouveau 5 minutes à 12000 g et éliminer le surnageant, le culot est séché afin
d'éliminer les traces d'éthanol. Le précipité est dissout dans 0,5mL de SSC (sodium saline citrate).
Méthodes d’extraction et de purification d’ADN plasmidique

Plasmide: Molécules d’ADN double brin libres le plus souvent circulaire, à localisation extrachromosomique, à
capacité de réplication autonome.
Structure et organisation
 Petites molécules d’ADN habituellement circulaire
 Existant indépendamment des chromosomes de l’hôte
 Présents chez nombreuses bactéries (quelques levures et mycètes)
 Réplication autonome (=réplicons) indépendamment des chromosomes
 Portent un nombre de gènes très réduit (≤30)
 A information génétique non-essentielle pour l’hôte
 En nombre variable:
 Plasmide à copie unique (1 seul/cellule hôte)
 Plasmides à copies multiples (40 ou + /cellule hôte)
1. Purification par Lyse alcaline
C’est Parmi les techniques les plus courantes de la biologie moléculaire, consistant à une préparation sélective de
l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien selon les étapes
suivantes:
 Lyse des cellules par le détergent (SDS) en présence de soude (pH 13) donnant une Dénaturation de
l'ADN total,
 Neutralisation rapide par acétate de potassium (pH 5,5) donnant une renaturation de l’ADN plasmidique
et une précipitation de l’ADN Chromosomique,
 Concentration de l'ADN plasmidique par précipitation à l'alcool et récupération de l’ADN par
centrifugation,
 Suspension de l’ADN plasmidique dans Eau pure et élimination des ARN par ribonucléases (hydrolyse
sélective des ARN/ ADN intact).
2. Purification par Gradient de chlorure de césium
 Les acides nucléiques sont séparés par ultracentrifugation isopycnique en chlorure de césium (CsCl). Ce sel
peut atteindre une densité très élevée, de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5mol/L.
 Un gradient de densité stable est réalisé par ultracentrifugation du CsCl en présence d’un agent intercalant le
Bromure d’éthidium ou BET reposant sur l’affinité du BET pour les différentes formes d’ADN. La densité
moyenne de l’ADN chromosomique bactérien et d’un plasmide sont différents en présence de BET.
 Les molécules d’ADN se séparent en fonction de leur densité indépendamment de leur taille ou de leur masse :
elles se stabilisent en cours de centrifugation au point où leur densité est égale à celle du milieu environnant.
Cette technique, appelée centrifugation isopycnique (à l’équilibre de densité), est utilisée pour la purification en
grande quantité les plasmides bactériens.
Les techniques d’extraction de L’ARN
Il existe différents protocoles pour extraire l‘ARN avec même schéma de principe:
 Lyse cellulaire mécanique (congélation, billes de céramique ou détergents) ou

enzymatique (lysozyme ou la lyticase),
 Protection des ARN de l’action des ARNases.
L’extraction des ARN peut être réalisée selon deux grands principes :
1) les différences de propriétés physico- chimiques entre les différents acides nucléiques et les
protéines ;
2) l’adsorption sélective des acides nucléiques sur un support solide.

 Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules: les ARN messagers (ARNm) représente
la classe la plus étudié. Se caractérisent par la présence du côté 3'terminal d'une longue
queue poly(A) synthétisée à la phase post-transcriptionnelle.
I. Méthodes de lyse et d’homogénéisation
 Une étape préalable de lyse cellulaire et d’inactivation des nucléases est préalablement appliquée avant tous
procédé d’extraction afin de préserver l’intégrité des ARN contenus dans chaque cellule.
 Lyse et homogénéisation seront menées en parallèle dans tous les autres cas. Différentes méthodes de lyse
cellulaire mécaniques ou enzymatiques existe selon les types cellulaires.
Bactéries, aux levures et aux virus afin de dissoudre des

Cellules et aux tissus structures (capsides, membranes bactériennes...)
inaccessibles à la rupture mécanique.
 Dans la plupart des cas, la lyse est réalisée dans des conditions dénaturantes pour casser
les cellules. En outre, la plupart des agents dénaturants utilisés sont de puissants
inhibiteurs des RNAses.
I. Méthodes de lyse et d’homogénéisation
 La méthode de référence décrite par Chirgwin et al. en 1979 homogénéisait les prélèvements dans une
solution 4 M de thiocyanate de guanidinium, agent puissant de dénaturation des protéines, additionné de
beta2-mercaptoéthanol qui permet de rompre les ponts disulfures protéiques.
 En 1987, Chomczynski et Sacchi ont ensuite amélioré cette méthode pour accélérer la procédure d’extraction
en combinant lyse au thiocyanate de guanidinium à la phase d’extraction au phénol-chloroforme.
 Cette modification s’est avérée particulièrement intéressante lors de la réalisation de grandes séries
d’échantillons ou lorsque l’on ne dispose que de petites quantités cellulaires ou tissulaires.
 À l’heure actuelle, la plupart des coffrets disponibles sur le marché reposent sur ces deux principes avec des
proportions de thiocyanate de guanidinium et phénol-chloroforme qui leur sont propres.
II. Méthodes d’extraction et de purification des ARN totaux
 Les cellules ou tissus cultivés sont lysés dans une solution de guanidinium. Le lysat est
ensuite appliqué sur un gradient graduel avec une couche inférieure contenant 5,7 M de
CsCl, qui dépasse la densité de l'ADN mais pas celle de l'ARN. Lorsque ceci est centrifugé
pendant 18h, l'ADN contaminant est piégé à l'interface entre le lysat et le CsCl haute
densité, l'ARN traversant la couche de CsCl et les granulés au fond.
Une étape de fraction qui réalise Le culot d'ARN est ensuite

une purification initiale de l'ARN. récupérée dans le phénol
chloroforme pour éliminer les
protéines résiduelles, puis précipité

II. Méthodes d’extraction et de purification des ARN totaux
 Si une petite quantité de CsCl est dissoute dans le lysat (1 g / 1,5 ml de lysat), ceci ajoute
une densité suffisante au lysat pour que les protéines s'accumulent sous la forme d'une
bande dénaturée au sommet.
Les techniques d’extraction de L’ARNm
 Dans certaines cas, il peut être préférable d’extraire les ARN messagers polyadénylés (poly (A+)) et non les ARN
totaux.
 En effet, dans une cellule de mammifère, les ARN messagers codant pour des transcrits spécifiques d’un type
cellulaire donné représentent moins de 10 % des ARN totaux produits.
Les 90 % restants correspondent aux
ARN impliqués dans les étapes
transcriptionnelles ou
traductionnelles (ARN ribosomaux
(28S, 18S et 5S), ARN de transfert,
ARN nucléaires et ARN mitochondrial.
 Parce qu’il comporte une queue

poly(A) d’environ 200 nucléotides
pour les cellules de mammifères,
l’ARN messager peut être purifié par
chromatographie d’affinité
Chromatographie d’affinité
ARNm se fixe sélectivement par

complémentarité de séquence sur des colonnes
d’oligo (dT). Deux approches peuvent être
utilisées : soit les ARNm sont purifiés à partir
des ARN totaux préalablement extraits, soit
directement à partir du prélèvement source
sans passage intermédiaire sous forme d’ARN
total

Exemples de chromatographie d’affinité
 Coffrets Sigma utilisent des oligo (dT) 30 liés de façon covalente à des billes de polystyrène de un
micromètre pour capter par hybridation des ARN polyadénylés. Les polystyrènes donnent moins de liaisons
non spécifiques que la cellulose et restent en suspension lors de l’hybridation avec les ARNm en l’absence
d’agitation.
 Coffrets Clontech utilisent des billes de latex coatées par des oligo (dT). Dans des conditions très salines,
les ARN poly(A) se lient aux particules de latex. Les billes latex-ARNm sont remises en suspension dans un
tampon de lavage et transférées sur un filtre permettant de recueillir facilement les billes de latex. Après deux
lavages, les ARNm sont élués dans un tampon peu salin.
2) Electrophorèse et analyse de l’ADN digéré par des enzymes de restriction
 Il existe plusieurs techniques pour analyser de façon globale la structure des
génomes et les fractionner en leurs composants. Parmi les techniques les
plus courantes en biologie moléculaire est l’électrophores sur gels d’Agarose
ou de polyacrylamide
Électrophorèse Électroce Phoresis
Énergie électrique Porter, avoir en soi (photo)
 L’électrophorèse: technique de biologie moléculaire permet de séparer des fragments d’ADN linéaires de
différente taille selon le principe du tamisage moléculaire.
Les molécules d’une taille comprise entre quelques centaines de paires de base et une
vingtaine de kilo bases ont une mobilité approximativement inverse au logarithme de leur
taille : c’est la méthode de choix pour déterminer la taille de fragments de restriction par
référence à un standard de fragments d’ADN de mobilité connue.
 Le principe est basée sur la séparation des acides

nucléiques chargés négativement à pH7~8 (à cause de
l'ionisation de leurs groupements phosphate), vers
l'anode (+) sous l'effet d'un champ électrique. Cette
séparation s'effectue à travers la matrice du gel en
fonction de la taille des molécules.
 Deux principaux polymères sont utilisés: l’agarose et le

polyacrylamide
L’agarose
 Est un polysaccharide formé d'alpha et de bêta-galactoses, extrait des algues
rhodophytes des genres Gellidium et Gracillaria.
Structure de l’Agarose
 Il forme un gel solide lorsqu’il est dissout dans une solution aqueuse à des
concentrations entre 0,5% et 2% (W/V). L’agarose utilisé pour
l’électrophorèse est une forme plus purifiée de l’agar utilisé pour les plaques
de la culture bactérienne.
Pourcentage d’agarose approprié pour les tailles des fragments à séparer

Polyacrylamide
 Le gel de polyacrylamide est constitué d'acrylamide de formule brute C3H5NO (extrêmement neurotoxique par
ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant.
 Les taux de ces deux substances sont variés afin d’obtenir différents maillages et donc différentes densités de
gel variant de 4% à 20% (poids/volume). La polymérisation est réalisée grâce à l'ajout de deux réactifs: le
TEMED (N,N,N',N'tetra-méthyl-èthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent des anions
hyperactifs en présence de lumière.
L’ADN est visualisé à l’aide de bromure d’éthidium, qui s’insère entre les plateaux
de base adjacents et fluoresce dans le rouge orangé quant on l’excité avec une
lumière de longueur d’onde inférieure à 300nm.
• Les fragments d’un DNA sont des anions et si on
les soumet dans un gel à un champ électrique,
ils migrent vers le pôle positif (anode) à une
vitesse d’autant plus grande qu’ils sont de taille
plus petite.
• On place dans un des puits de dépôt des

fragments de DNA de tailles connues pour servir
de marqueurs de taille.
• On ajoute dans les dépôts deux colorants : un bien visible sur le gel qui va migrer très rapidement avant les
fragments de DNA pour limiter la distance parcourue au bord de l’anode ; un autre, le bromure d’éthidium qui
se fixe spécifiquement au DNA quelle que soit la séquence et qui émet une fluorescence mauve lorsqu’on
l’éclaire avec des rayons ultra-violets. On examine le gel sous lumière ultra-violette à 254 nm et on
photographie les fragments de DNA digéré.
3) Analyse de l’ADN digéré par des enzymes de restriction
 La digestion de l’ADN génomique ou plasmidique pour des fins analytiques ou préparatoires est effectuée
grâce aux enzymes de restriction.
 Les enzymes de restriction sont des endonucléases synthétisées par des bactéries pour se protéger des
infections de virus (bactériophages). Ces enzymes coupent l’ADN viral à des endroits spécifiques.
Les systèmes de restriction/ modification apparaissent dans différentes espèces bactériennes

comme mécanisme de défense. Ils sont composés de deux constituants :
Le premier est l’endonucléase de Le second constituant du système est une

restriction qui reconnait une courte méthylase, qui ajoute un groupement
séquence d’ADN symétrique et hydrolyse le méthyle à la base A ou Cà l’intérieur des
squelette de l’ADN dans chaque brin à un mêmes séquences de reconnaissance dans
site spécifique à l’intérieur de cette l’ADN cellulaire. Cette modification permet à
séquence. Ainsi l’ADN étranger sera l’ADN hôte de résister à la dégradation grâce
dégradé en fragments relativement courts. à l’endonucléase.
Action des endonucléases de restriction à leurs séquences de reconnaissance

 EcoR I est une enzyme de restriction produite par
Escherichia coli, souche R.
 Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de

nucléotides :
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG
 Les sites de restriction sont souvent de type

palindrome, c’est à dire qu’ils sont identiques sur les
deux brins de l’ADN (mais antiparallèles sur l’autre brin).
 La méthylation des adénines ou de la cytosine du site d’hydrolyse inhibent la

reconnaissance du site par EcoRI. L’ADN de la bactérie ainsi méthylé n’est pas hydrolysé
alors que l’ADN parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.
 Hae III est une enzyme de

restriction produite par
Haemophilus aegypticus.
 Le site de liaison à l’ADN est

formé de quatre paires de
nucléotides :
5’ GGCC 3’
3’ CCGG 5’
Exemple d’analyse d’ADN plasmidique digéré par des enzymes de restriction
• La digestion d’un plasmide avec deux enzymes de restriction différentes

BamHI et EcoRI est illustrée par gel d’électrophorèse
• Le plasmide a parcouru le gel sans digestion (piste U), et après la

digestion avec BamHI (piste B) et EcoRI (piste E).
• Un ensemble de fragments d’ADN marqueur linéaire de taille connu

(piste M) a parcouru des prélèvements à deux différentes
concentrations.
 L’ADN plasmide non digéré (Piste U) parcourt le gel agarose

fréquemment composé de deux bandes. La bande
inférieure, plus mobile, est constituée d’ADN plasmide
surenroulé isolé intact de la cellule. Celle-ci possède une
grande mobilité en raison de sa conformation compacte.
 La bande supérieure est circulaire- ouverte, ou ADN à

césure formée par l’ADN surenroulé par le fractionnement
d’un brin ; celle-ci possède une conformation ouverte
circulaire et une faible mobilité
 Les voies contenant l’ADN digéré montre clairement un seul

fragment (Piste B) et cinq fragments (Piste E) dont les tailles
peuvent être estimées par leur comparaison avec les pistes
marqueurs (M).
 Les intensités des bandes dans la piste E sont proportionnelles

aux tailles des fragments, du fait qu’un petit fragment possède
moins de masse d’ADN à une concentration molaire donnée.
 La quantité de l’ADN présente dans les pistes U, B et E n’est pas

égal.
PCR et la RT-PCR
I. La Réaction de Polymérisation en Chaine ou PCR
 Cette technique a été mise au point par le scientifique américain Karry Mullis en 1983 et
développée par le H.A. Herlich avec la collaboration du laboratoire Cetus Corp à Emery ville,
Californie en 1985.
 La polymérase chaine réaction ou PCR est une technique de réplication ciblée in vitro, Elle
permet d’obtenir à partir d’un échantillon d’ADN génomique complexe appelée séquence
cible de petite taille, d’importantes quantités d’ADN spécifique et de longueur définie.
 L’ADN cible est ainsi amplifié plus d’un million de fois et devient la molécule d’ADN majoritaire
dans le milieu réactionnel. La quantité obtenue finalement est suffisante pour pouvoir
manipuler le gène amplifié ou en faire des analyses détaillées.
PCR et la RT-PCR
II. Eléments utilisés dans la PCR
L’ADN matrice : il contient la séquence d’ADN cible à amplifier.
Amorces d’oligonucléotides : la PCR requiert une paire d’amorce oligonucléotides. Ce sont des
petites molécules d’ADN simple brin généralement 20-25 bases obtenues par synthèse chimique.
Les séquences d’amorces sont choisies sur la base d’appariement complémentaire aux brins
d’ADN opposés de chaque coté de la séquence qu’on désire amplifier.
Une ADN polymérase : L’enzyme communément utilisée est la Taq ADN polymérase de Thermus
aquaticus, une bactérie vivant dans des milieux chauds. Le rôle de l’ADN polymérase en PCR est
copier les molécules de l’ADN. L’enzyme en présence d’amorces se fixe à l’ADN simple brin et
synthétise un nouveau brin complémentaire du brin d’origine.
Des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTPs) : Ces molécules représentent les quatre bases
de l’ADN (guanine, adénine, cytosine, thymine) nécessaire dans toute PCR et qui sont utilisés par
l’ADN polymérase pour la synthèse du nouvel ADN.
PCR et la RT-PCR
III. Cycle de PCR :
La technique de PCR permet d'amplifier de manière exponentielle une région bien précise du
génome. Des oligonucléotides simple brin sont synthétisés et s'hybrident avec la région
homologue de l'ADN. La réaction de polymérisation s’effectue en trois étapes qui se déroulent
à différentes températures et aboutissent ensemble à la synthèse de l’ADN cible.
PCR et la RT-PCR
III. Cycle de PCR :
1) Dénaturation :
 La première étape s’effectue à une température de 94°C, dite température de dénaturation.

À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de matrice au cours de la réplication, est
dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température
supérieure à 80°C et les ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin (ADN
monocaténaires).
PCR et la RT-PCR
III. Cycle de PCR :
2) Appariement des amorces ou hybridation :
 La deuxième étape s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 60°C,
dite température d’hybridation des amorces. La diminution de la température permet aux
liaisons hydrogènes de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider.
 Les amorces, courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent

l’ADN à amplifier, s’hybrident plus facilement que les longs brins d’ADN matriciel.
 La température d’hybridation (Th) d’une amorce est en déduite à partir de la formule de
Wallace pour la Tm (température de fusion):
Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Th= Tm – 5 en (°C)
PCR et la RT-PCR
III. Cycle de PCR :
3) Elongation :
 La troisième étape s’effectue à une température de 72°C, dite température d’élongation. À
72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication
en utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel.
Les régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées.
 Un totale de 20 à 40 cycles est mené à bien, en fonction de l’abondance initiale de la
séquence cible. Afin de programmer les changements de températures nécessaires, la PCR
se déroule dans un bloc de chauffage contrôlé électriquement appelé cycleur thermique ou
thermocycleur.
PCR et la RT-PCR
III. Cycle de PCR :
PCR et la RT-PCR
PCR et la RT-PCR
III. Cycle de PCR :
La réaction de polymérisation en chaine (PCR)

PCR et la RT-PCR
IV. Applications de la PCR :
 La PCR est utilisé en routine comme outil de recherche et elle a permet d’amélioré la capacité
d’étude des gènes. En fait, de nombreuses études en génétique moléculaire impliquent
l’utilisation de la PCR à une étape au moins, normalement comme élément de la stratégie
globale et en association avec d’autres techniques. Par exemple, de l’ADN amplifié par PCR
peut être utilisé pour le séquençage, comme sonde dans du southern blot ou du northern
blot.
 La PCR est utilisée dans la plupart des domaines de la biologie et de la médecine, mais
également dans d’autres domaines exceptionnels, comme l’anthropologie ou l’archéologie.
C’est aussi un outil dans les industries des biotechnologies
 La PCR a apporté d’importantes contributions aux domaines suivants:
- Les maladies héréditaires - La recherche contre le cancer

- Les sciences médico-légales - Les biotechnologies
La RT-PCR
I. Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
La RT-PCR est une variante extrêmement utile de la PCR standard qui permet
l'amplification de transcrits d'ARNm spécifiques à partir de très petits
échantillons biologiques. C’est la méthode la plus sensible pour détecter les
ARN messagers au niveau d’un organe, d’un tissu ou d’une cellule.
La RT-PCR
II. Principe de la Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
 Le principe consiste à extraire les ARN totaux des tissus étudiés et de les copier in vitro en ADNc simple-brin,
grâce à l’action de la transcriptase inverse. Les molécules d’ADN obtenues servent de matrice à une réaction
de PCR. Les fragments PCR obtenus après les cycles de PCR sont visualisés par électrophorèse sur gel.
La RT-PCR
II. Principe de la Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
 L’une des difficultés de la technique est la contamination de la préparation des ARNs par
l’ADN génomique; en effet, les amorces se fixeront tout aussi bien sur l’ADN simple-brin issu
des ARNs que sur l’ADN génomique contaminant.
 L’une des possibilités est de travailler à partir d’ARN polyadénylés purifiés. Il est aussi
possible d’éviter cet artéfact en traitant les échantillons d’ARN par une désoxynucléase afin
d’éliminer toute trace d’ADN génomique.
La RT-PCR
III. Application de la RT- PCR
 La Reverse Transcription-PCR constitue une technique très sensible dans laquelle un
nombre faible de copies de molécules d'ARN peut être détecté. Elle est largement utilisée
dans le diagnostic des maladies génétiques et, dans la détermination de l'abondance de
différentes molécules d'ARN spécifiques dans une cellule ou un tissu afin de mesure
l'expression génique.
 Elle trouve aussi son application dans les domaines suivant :
a) Méthodes de recherche : Par exemple, utilisé la RT-PCR pour mesurer l'expression des gènes Gal
dans des cellules de levure.
b) Insertion de gènes : La RT-PCR peut également être utilisé pour insérer des gènes eucaryotes dans
des êtres procaryotes. Elle est couramment utilisée dans l’étude des génomes de virus à ARN, tels
que le virus de l’influenza A et VIH.
c) Détection et étude du cancer : utiliser la RT-PCR dans la détection du cancer pour améliorer le
pronostic et surveiller la réponse au traitement
Transformation de bactéries
 La transformation de bactéries fut décrite la première fois par Fred Griffith en 1928,
montrant qu’une souche non virulente, non capsulée et rugueuse du Streptococcus
pneumoniae pouvait être convertie en une souche virulente, encapsulée et douce après
ajout de cellules douces tuées par la chaleur.
 Oswald Avery et son équipe démontra, dans les années 1930, que le « principe transformant
» était l’ADN et non les protéines de la cellule. Ils ont eu beaucoup de chance dans le choix
de micro-organisme expérimental car seulement quelques espèces sont naturellement
capables de prendre l’ADN de l’environnement : le Streptocoque, le Bacillus, le Neisseria,
l’Haemophilus et certaines espèces d’Archaébactéries.
Il est possible de transférer in vitro de l’ADN extrait d’une culture bactérienne jusqu’à une
bactérie receveuse. Ce processus s’appelle transformation.
I. État de la compétence des bactéries transformant

 Toutes les espèces d’un genre ne sont pas nécessairement capables de se transformer, ni toutes les cellules
d’une population. La capacité d’une cellule bactérienne à prendre l’ADN est liée au développement d’un état
compétent où des récepteurs d’ADN et des protéines spécifiques à la transformation sont présents à la surface
de la cellule, permettant à un fragment d’ADN d’entre en contact avec la cellule compétant, ce fixer et y
pénétrer.
 Par exemple, chez le Neisseria

gonorrhoeae, seules les cellules pilées
sont compétentes.
I. État de la compétence des bactéries transformant
La compétence dépond généralement des conditions de la croissance. Cette compétence
peut être acquise par:
Seulement quelques cellules dans une culture (B. subtilis)
Par presque toutes les cellules (S. pneumoniae), cela dépend du genre.
La compétence peut être perdue pendant quelques minutes (S. pneumoniae) ou
plusieurs heures (B. subtilis).
Certaines espèces naturellement non transformables peuvent être poussées à

devenir compétentes par exemple E.coli en utilisant des traitements chimiques,
cette compétence n’est pas identique à la compétence naturelle.
II. Transformation naturelle
 La transformation naturelle est un processus à plusieurs étapes.

L’ADN double brin doit d’abord se lier à une cellule compétente.
Un brin est ensuite hydrolysé alors que le second brin intact est
transféré dans la cellule. Le fragment simple brin arrivant
interagit avec des protéines qui intègrent l’ADN dans le
chromosome du receveur.
 Bien que connaissant la machinerie de base, les scientifiques

n’ont toujours pas déterminé le mécanisme précis par lequel
l’ADN entre dans la cellule ou comment chaque composant
interagit avec l’ADN.
III. Transformation de bactéries rendues compétente par un traitement au chlorure de calcium
 Les généticiens des microbes tirent avantage de la transformation pour faire entrer l’ADN
(habituellement de l’ADN recombinant) dans les cellules. Cependant, comme noté
précédemment, beaucoup d’espèces, dont E. coli, ne sont pas naturellement compétentes
pour la transformation. Ces bactéries peuvent être rendues compétentes artificiellement par
certains traitements.
L’électrochoc et l’exposition au chlorure de calcium (CaCl2) sont deux techniques
couramment employées.
Ces deux approches rendent la membrane cellulaire plus perméable à l’ADN et toutes deux ont été utilisées pour
préparer des cellules d’E.coli artificiellement compétentes.
 Pour augmenter la fréquence de transformation chez E. coli, on emploie des

souches qui manquent d’une ou de plusieurs nucléases. Ces souches sont
particulièrement importantes lorsqu’on transforme les cellules avec de l’ADN
linéaire, qui est sensible à l’attaque des nucléases.
 Il est plus facile de transformer des bactéries avec de l’ADN plasmidique, parce
que les plasmides peuvent se répliquer dans leur hôte, et ne sont pas aussi
aisément dégradés que les fragments linéaires.
III.1 Préparation des cellules compétentes
 Les cellules à traités ont été préalablement mis en culture jusqu’à leur phase exponentielle
de croissance, car dans cette phase les cellules sont en division ce qui facilitera la
transformation. Ensuite, la culture E.coli est centrifugée pendant 10 minutes à 2500 rpm
afin de concentrer les cellules.
 Le culot est re-suspendus dans un tampon Tris HCl et CaCl2 afin de les rendre compétentes
pour la transformation. En effet, en présence d’une solution concentré en ions Ca la
structure des membranes cellulaire va être altéré et il y aura la création de plusieurs micro
perforations par lesquels l’ADN pourra pénétrer les cellules vont être capables d’ingérer des
petites molécules d’ADN, comme un plasmide.
 Toutes les opérations ont été effectuées à 4°C a fin de ne pas endommager les bactéries.
III.2 Transformation des cellules compétentes
 Dans cette étape les cellules d’E.coli rendues artificiellement compétente sont mélangées
avec de l’ADN plasmidique, le mélange est laissé reposer pendant 30 minutes afin
d’accentuer la réaction précisé précédemment. Ce mélange est incubé 1 minute à 42°C, ce
choc thermique induit un stress important qui fragilise la membrane et facilitera l’entrée de
l’ADN plasmidique dans les cellules d’E.coli compétentes.
 Du milieu Soc est ajoutée au tube afin de régénérer la membrane bactérienne au plus vite.
Les tubes sont agités à 37°C pendant 45 minutes ce qui a permis de continuer la
régénération de E.coli à sa température optimal .Cette étape a également permis d’obtenir
la synthèse de la protéine qui confère la résistance à l’antibiotique. Enfin, les cellules
transformées sont ensemencées sur un milieu LB solide additionné d'antibiotique afin
d'identifier celles qui contiennent l'ADN plasmidique.
Clonage
 Le terme clone est utilisé pour la première fois en 1903 par le botaniste H.J. Webber en
désignant des plantes reproduites par multiplication asexuée.
 Le clonage désigne principalement le processus de multiplication d'un organisme, d'une

cellule souche ou d'un gène, en grand nombre d'exemplaires identiques. Depuis plus de
vingt ans, le clonage, ou la reproduction exacte de gènes particuliers et de types individuels
de cellules, est une technique employée en biotechnologie afin de produire des
médicaments et des vaccins pour traiter plusieurs maladies.
Le clonage cellulaire: On fait

Le clonage moléculaire le quel on
plusieurs exemplaires de la même
développera particulièrement dans
cellule pour pouvoir faire des
cette partie.
recherches médicales.
Le clonage moléculaire
 Le clonage de l’ADN est une technique puissante qui permet de séparer des séquences
spécifiques d’ADN au sein d’autres séquences puis de les copier de sorte qu’on obtient des
quantités importantes permettant une analyse détaillée ou des manipulations.
Une importante utilisation du clonage de l’ADN est d’isoler de
nouveaux gènes en leur permettant d’être explorés et caractérisés.
La molécule d’ADN à cloner est insérée dans une autre 1

molécule d’ADN généralement circulaire, appelée un vecteur.
Le vecteur recombinant est introduit dans une cellule hôte, généralement la

2
bactérie E.coli, où il produit de multiples copies de lui-même. 3
Lorsque la cellule hôte se divise, des copies du vecteur sont ainsi produites et
elles peuvent être purifiées à partir des cultures de cellules hôtes et utilisées
pour l’analyse de l’insert d’ADN étranger
Outils de clonage
1. Les enzymes de restriction
 Joindre les molécules d’ADN ensemble pour le clonage dépend de l’utilisation d’enzymes de bactéries appelées
endonucléases de restriction.
 La coupure réalisée par l’enzyme de restriction n’est généralement pas franche, c’est-à-dire que les deux
brins de la double hélice sont coupés à quelques bases de distance. Ceci crée des portions simples brins qui
dépassent, et qu’on appelle extrémités cohésives ou bouts collants.
 Il existe des enzymes qui coupent de façon franche les deux brins au
même endroit.
 lorsque les molécules sont jointes par des extrémités cohésives,
elles ne sont pas liées de façon covalente. Une enzyme appelée ADN
ligase, est utilisée pour catalyser la formation d’une liaison
phosphodiester entre deux molécules d’ADN, les recombinant ainsi
de façon permanente.
 Il existe plusieurs systèmes pour cloner des molécules d’ADN, en fonction du type de vecteur utilisé. Chacun
présente ses propres caractéristiques et utilisations
1. Les enzymes de restriction
Action d’enzymes de restriction sur l’ADN

2. Procédure de clonage selon les vecteurs utilisés
2.1. Plasmide
 Les plasmides forment le type le plus commun de vecteur de clonage.
Le plasmide est digéré par une enzyme de

L’ADN étranger à cloner est lui aussi digéré
restriction qui le coupe en un site unique et
par la même enzyme de restriction pour
transforme la molécule circulaire qu’il était en
produire les mêmes bouts collants.
une molécule linéaire avec des extrémités
cohésives.
2.1. Plasmide
 Le plasmide et l’ADN étranger sont mixés, des molécules plasmides sont jointes à des
molécules d’ADN étranger via leurs extrémités cohésives communes et on obtient des
plasmides recombinants circulaires.
 L’ADN ligase est utilisé pour joindre de façon covalente les deux,
2.1. Plasmide
 Le plasmide recombinant est introduit dans la bactérie hôte (généralement E. coli) par un processus appelé
transformation.
 Les bactéries transformées sont ensuite étalées sur des plaques d’agar et les colonies des bactéries
composées de cellules ayant correctement intégré le plasmide recombinant croissent (Résistance qu
antibiotiques).
 Des colonies individuelles sont séparées et cultivées en milieu liquide. De grandes quantités de plasmides
peuvent alors être purifiées à partir des cultures et on peut récupérer l’ADN cloné pour l’analyse.
2.2. Le phage lambda (λ)
 Le phage λ a été adapté à une utilisation comme vecteur de
clonage.
 La portion centrale de l’ADN de λ, qui n’est pas essentielle à
l’infection, est détruite, laissant des fragments 5’ et 3’
appelés bras.
 La région ayant subit la délétion peut être remplacée par
l’ADN étranger pour produire un phage à ADN recombinant.
 Celui-ci est inséré dans les capsides phagiques in vitro par
un processus appelé empaquetage qui suppose de
mélanger l’ADN du phage recombinant avec un extrait
d’empaquetage contenant les protéines de la capside du
phage et des enzymes nécessaires à la fabrication.
 Des particules de phages recombinants sont produites et
elles infectent E.coli avec une grande efficacité.
 Les cellules infectées sont étalées sur une plaque d’agar et

produisent un feuillet continu de bactéries appelé une
couche qui contient de petites zones de la taille d’une
épingle à cheveux.
 Ces zones correspondent aux plages de lyse produites par

l’infection phagique. Des plages individuelles peuvent être
isolées et utilisées pour générer des quantités importantes
d’ADN cloné par infection de cultures fraiches d’E.coli.
 Le principal avantage de λ en tant que vecteur de

clonage est que la taille des fragments qui
peuvent y être insérés est bien supérieure à celle
des inserts plasmidiques.
 Le phage λ peut en effet héberger des fragments

long jusqu’à 25Kpb, à comparer aux 10Kpb
maximales des inserts dans les vecteurs
plasmidiques. Cette possibilité de cloner de plus
larges fragments a conduit au développement de
la principale utilisation de λ dans la construction
de banques d’ADN.
2.3. Cosmides
 Ce type de vecteur combine des caractéristiques rencontrées chez les plasmides et le phage λ.
 Les cosmides ont tous les trais normaux des plasmides, Les gènes conférant une résistance à des antibiotiques,
mais ils incluent aussi des séquences issues de λ appelées séquences cos.
Elles sont situées aux deux extrémités de la

molécule d’ADN de λ et sont responsables de son
insertion dans la capside du phage.
 Cloner avec des cosmides combine des caractéristiques

associés à l’utilisation de λ et de plasmides comme
vecteur de clonage. L’ADN des cosmides est clivé par une
enzyme de restriction et lié à l’ADN étranger.
2.3. Cosmides
 Le cosmide recombinant est ensuite empaqueté
dans les capsides de λ et utilisé pour infecter
E.coli.
 Les cosmides ne contiennent pas tous les gènes

de λ et ne forment donc pas de plages après
infection. Au lieu de cela, les cellules infectées
sont cultivées sur de l’agar contenant des
antibiotiques et les colonies résistantes
contenant des cosmides recombinants sont
isolées et peuvent être amplifiées de la même
façon que des plasmides.
2.3. Cosmides
 Les cosmides ont l’avantage d’être

capable d’héberger de très gros inserts.
Sachant que les cosmides sont petits,
typiquement 8Kpb et que la capside de λ
peut accueillir 52Kpb, les inserts
cosmidiques peuvent mesurer jusqu’à
44Kpb.
Application du clonage de l’ADN
Le clonage de l’ADN est une technique puissante qui a apporté d’importantes contributions
dans de nombreux domaines de la recherche biologique, principalement :
L’identification de gènes impliqués dans des maladies ;

La cartographie des génomes ;
La production de protéines recombinantes ;
Les organismes génétiquement modifiés.
 Le séquençage d’ADN est la détermination de la succession des nucléotides. C’est devenu un
outil essentiel en biologie moléculaire tant en médecine que dans de nombreuses autres
disciplines des sciences de la vie.
 Le séquençage a été décrit il y a environ 55 ans par la méthode de Sanger et la méthode de

Maxam et Gilbert, depuis cette période cette technique n’a cessé d’évoluer.
 La méthode de détermination des chaines par un didésoxy c'est-à-dire la méthode de Sanger

a aujourd’hui surpassé la méthode chimique car elle est à la fois plus efficace et plus facile à
mettre en œuvre. C’est devenu une technique courante dans les laboratoires de biologie
moléculaire. Les connaissances acquises grâce à cette méthode et la possibilité de séquencer
I. Séquençage 1ère génération : méthode de Sanger
 Méthode mise au point par Frederick SANGER dans les années 1970, grâce à cette
technique, son équipe a identifié la première séquence complète d'un virus, celui du
bactériophage phi X174 (Sanger et al., 1977).
 L’ADN à séquencer est appelé l’ADN matrice. Il doit être obtenu sous forme purifiée et être
homogène; c’est-à-dire qu’il ne doit contenir que des molécules d’ADN ayant la même
séquence.
 On utilise couramment comme matrice de l’ADN cloné ou produit par PCR.
 L’ADN utilisé dans cette méthode doit être simple brin afin d’être copié par l’ADN
polymérase. Il est produit par dénaturation de la matrice d’ADN double brin via un
traitement thermique ou alcalin.
 De nombreuses ADN polymérases sont utilisées pour la réaction de séquençage. Les
principales sont le fragment de Klenow (une partie de l’ADN polymérase I d’E.coli), une ADN
polymérase modifiée tirée du phage T appelée la Séquenase et la Taq ADN polymérase, qui
est aussi utilisée en PCR.
 Toutes ces ADN polymérase on besoin d’une région d’ADN double brin pour pouvoir initier
la synthèse d’ADN à partir d’une matrice simple brin. Celle-ci est fournie par addition, dans
le milieu réactionnel d’amorces qui s’apparient à l’ADN matrice et déterminent ainsi le point
où commencera le séquençage.
On prépare quatre milieux réactionnels différents, tous contiennent :
 L’ADN matrice sous forme simple brin,

 L’ADN polymérase,
 Aamorces, les quatre
 Désoxynucléotide triphosphate (dNTP) nécessaires à la construction du nouvel ADN.
 Chacun contient un nucléotide modifié différent, appelé un didésoxynucléotide
(ddNTP).
 ddNTP
 Il y a quatre ddNTP qui correspondent aux quatre bases de l’ADN. Ils diffèrent des dNTP par l’absence de groupe
hydroxyle sur le carbone 3’ du sucre.
 Ils sont incorporés à l’ADN en croissance par la polymérase, mais cette absence de l’hydroxyle en 3’ empêche de
former un lien phosphodiester avec le nucléotide qui devrait être ajouté ensuite. Ceci interdit de poursuivre
l’élongation du polynucléotide d’ADN en cours de synthèse.
 Les ddNTP jouent ainsi le rôle d’inhibiteurs de la synthèse de l’ADN.

 Chacun des quatre milieux réactionnels préparés pour le séquençage contient un ddNTP
différent. Suivant le ddNTP qui est présent, la synthèse se termine à l’endroit où ce nucléotide
modifié est incorporé.
 Atout moment, durant la synthèse d’ADN, la polymérase peut incorporer à la chaine en
élongation soit un dNTP soit un ddNTP. Dans le premier cas, la synthèse continue tandis que
dans le second, la synthèse s’achève en cette position.
 L’effet global est que dans chacune des quatre

préparations, est produite une série de
molécules d’ADN de différentes longueurs qui se
terminent en une position où dans la matrice
est présente la base complémentaire de celle
dont la forme de didésoxynucléotide est
présente dans le milieu réactionnel considéré
 A l’issue de la réaction de séquençage, les molécules d’ADN synthétisées sont séparées suivant
leur taille par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec les quatre préparations versées
sur quatre lignes parallèles du gel.
 Si on ajoute des dNTP contenant du phosphore ou du soufre radioactif dans les préparations
de séquençage, les ADN synthétisés deviennent radioactifs ce qui permet de les détecter par
autoradiographie.
 Lorsque le film est développé, une série de bande

est observée dans chacune des lignes du gel. La
séquence de l’ADN matrice peut être déterminée
en identifiant les plus petites bandes et les bandes
de plus en plus grosses et associant la ligne dans le
gel à la base terminale
 Les didésoxynucléotides peuvent être marqué plutôt que les amorces, ce qui permet
d’utiliser un seul mélange au lieu de quatre. Chaque didésoxyribonucléotides est marqué
par un fluorophore spécifique. Les fragments d’ADN synthétisés portent ce fluorophore
terminal. Ils sont nommés des terminateurs d’élongation ou Big Dye terminators ou Dye-
labeled terminator.
 Cette adaptation a été proposée par Smith et al. nommer séquençage par arrêt de synthèse
à l’aide d’un terminateur marqué (deyterminator sequencing) (Smith et al., 1986). C’est la
technique actuellement utilisée dans certains séquenceurs automatisés.
II. Séquençage automatisé de l’ADN
 La méthode de Sanger a été développée durant ces dernières années, et cela revient à
plusieurs avancées technologiques importantes :
 Le développement de la synthèse chimique automatisée des oligonucléotides qui sont utilisés comme
amorces dans la synthèse.
 L’introduction de traceurs fluorescents à la place des marqueurs radioactifs utilisés initialement.
 L’adaptation de la technique PCR pour le séquençage.
 L’utilisation de séquenceurs automatiques de gènes
 L’utilisation de l’électrophorèse capillaire pour séparation et l’analyse
 Les séquenceurs en gel plat et les séquenceurs capillaires ont permet une automatisation
de la techniques dans les laboratoires utilisant couramment le séquençage.
II. Séquençage automatisé de l’ADN
L’automatisation du séquençage consiste l’emploi de :
 Système d’électrophorèse piloté par ordinateur,
 Marqueurs fluorescents de différentes couleurs qui sont révélés après excitation par
laser à l’aide d’une caméra CCD
 Des logiciels permettant l’analyse des signaux sortant de l’appareil et leur mise en
forme sous forme de résultats (électrophorégramme et séquence)
 Un robot passeur d’échantillon permettant d’enchainer les échantillons les uns à la
suite des autres (passage de plaques de réaction à 96 puits).

Exemple d’enregistrement obtenu à partir d’un séquenceur automatique
Southern blot principe et technique
 Le Southern blot est une technique décrite
par Edwin M. Southern en 1975 pour
rechercher spécifiquement des fragments
de DNA sur électrophorèse en les hybridant
avec une sonde complémentaire marquée
par un radioisotope.
Les étapes successives de cette technique sont les suivantes
1. Extraction et purification de l’ADN génomique.
2. L’ADN à étudier est digéré à l’aide d’enzymes de restriction différentes en de très nombreux fragments par
exemple dans le tube 1, une digestion par l’enzyme 1 est réalisée, dans le tube 2 une digestion par l’enzyme 2, …
3. Le mélange des fragments est soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose.
4. Le gel d’électrophorèse est ensuite immergé dans une solution alcaline (hydroxyde de sodium) afin de
permettre la dénaturation de l’ADN bicaténaire en ADN monocaténaire.
5. Afin de repérer les fragments d’intérêt, il faut en premier les hybrider. L’hybridation ne peut pas être effectuée
sur le gel dont la structure immobiliserait les sondes, de ce fait il faut transférer les fragments sur un filtre de
nitrocellulose ou de nylon. L’emplacement des fragments séparés par l’électrophorèse est conservé au cours du
transfert.
6. En pratique, un montage est réalisé en disposant par-dessus le gel, une feuille de membrane de nitrocellulose
ou de nylon recouverte d’une pile de papier absorbant puis en comprimant gentiment l’ensemble par un poids, les
fragments sont transférés grâce à une montée par simple capillarité de tampon imprégnant le gel puis la
membrane où le DNA va se fixer par des liaisons stables.
7. afin de fixer de manière permanente l’ADN sur la membrane, cette dernier est alors chauffée dans le cas de
nitrocellulose ou exposée au rayonnement UV s’il s’agit de nylon.
8. La membrane avec l’ADN fixé est ensuite incubée dans une solution contenant une sonde marquée
complémentaire du fragment de DNA que l’on recherche a révélé la position, la température d’incubation est
assez basse pour que l'hybride se forme mais assez élevée pour que cet hybride soit parfaitement
complémentaire.
9. La membrane est ultérieurement lavée des molécules de la sonde qui ne sont pas fixées à leur DNA
complémentaire.
10. Selon le type de sonde utilisée, la position sera déterminée par autoradiographie ou par fluorescence.
L’information obtenue est double : la présence de marquage confirme la présence de la séquence d’intérêt et sa
position permet de déterminer la taille du fragment de restriction.
Southern blot principe
et technique
II. Application de la technique du Southern blot
 Le Southern blot peut détecter la présence des gènes homologues entre les espèces.
 Par exemple, si un gène d’intérêt biologique a été localisé chez le rat, il est possible de
construire une sonde marquée à partir du gène de rat et de l'utiliser pour rechercher un gène
homologue chez l'homme par analyse Southern bolt.
 L'analyse Southern permet d'identifier des mutations, des délétions ou des réarrangements
qui altèrent l'intégrité d'un gène spécifique, ce qui peut être utile dans le pronostic de
certains types de cancer et dans le diagnostic prénatal de maladies génétiques.
 De plus, le Southern blot est un outil précieux pour le clonage moléculaire, offrant un
mécanisme de localisation des séquences spécifiques dans des clones d’ADN de
bactériophages et de cosmides.
Northern blot (principe et technique)
• Cette technique a été appelée en référence au Southern blot. Le northern blot est une
technique simple et couramment utilisée pour la détection et la quantification d’ARN
spécifiques provenant d’un type de cellule ou de tissu particulier.
• Dans cette méthode, les molécules ARN total ou ARNm sont isolés et séparés par
électrophorèse sur gel d’agarose selon leurs tailles.
Le gel est préparé avec du formaldehyde
pour dénaturer l'ARN et empêcher la
• Après la séparation sur le gel d’agarose, l’ARN est formation de structures secondaires
coloré au bromure d’éthidium et visualisé à la
lumière ultraviolette.
• Les ARN complémentaires de la sonde sont identifiés après transfert sur une membrane de
Nylon ou de nitrocellulose qui est ensuite soumise à l’hybridation.
• La sonde peut être une molécule d’ADN ou d’ARN, marquée chimiquement ou

radioactivement. Selon le type de marquage les molécules d’ARN seront déterminées par
autoradiographie ou par fluorescence.
II. Application de la technique du Northern blot
 Le Northern blot et ses variations sont utilisés dans la recherche en biologie moléculaire
afin d’évaluer la taille de l’ARN étudié ainsi que la taux d’expression et d’accumulation d’une
population d’ARN dans un tissu donné (feuille, racine, tige,,,) à un moment déterminé de
son développement (différentes phase de l’embryogenèse) ou sous l’effet d’un stress
biotique ou abiotique.
 Aussi elle permet d’étudier la dégradation de l'ARN et leur demi-vie. Enfin cette technique
sert à détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes d'épissage des
ARN.
Western blot (principe et technique)
 En 1979, H. Towbin et ses collaborateurs ont mis au point la technique de
Western Blot ou immunoblot pour détecter une protéine nouvellement codée
par une cellule transformée.
 Son principe repose sur la réaction antigène-anticorps; il s’agit donc d’une
technique d’immunodétection.
 Dans cette méthode, les sondes d'acide nucléique radiomarquées ne sont pas
utilisées
Cette technique se déroule en plusieurs étapes:
1. Extraction des protéines à partir des cellules et séparation par SDS-PAGE (électrophorèse
sur gel depolyacrylamideen présence dedodécylsulfate de sodium) en fonction de leur taille, le
SDS servant de détergent pour l'électrophorèse et de dénaturant pour les protéines a
structure tridimensionnel.
2. Une fois que les protéines ont migré, elles sont transférées sur une membrane de
nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La liaison des protéines à la membrane
se fait grâce à des interactions hydrophobes et ioniques entre la membrane et les protéines.
3. Incubation de la membrane de nitrocellulose avec un anticorps primaire, qui est un anticorps
spécifique qui se lie aux protéines et forme un complexe anticorps–protéines d’intérêt. Le
lavage de la membrane est effectué à l’aide d’une solution de lavage pour éliminer tous les
anticorps non hybridés.
4. Addition d’un anticorps secondaire qui est conjugué à de la couleur, de la radioactivité ou une
enzyme aux fins de la détection.
 Par exemple : un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à de la peroxydase de
raifort (horseradishperoxidase; HRP) qui est considérai comme une enzyme conjugué
permettant la visualisation de la protéine d’intérêt.
5. Incubation dans un milieu réactionnel spécifique de l’enzyme pour visualisé sont action.
Les bandes sont visible une fois il y a formation du complexe protéine-anticorps primaire-
anticorps secondaires–enzyme. Un filme radiographique est exposé au gel et les
séquences hybrides sont détectées par autoradiographie. Les bandes montrent la
présence de protéines recherchées.
Représentation de la technique de western blot
Un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin

conjugué à de la peroxydase de raifort (HRP)
pour détection des protéines d’intérêt
Avantages et applications de la technique de western blot
 Le Western blot présentes beaucoup d'avantages par rapport à d'autres dosages d'immuno-
absorption tels que la méthode d’ELISA.
 Le Western blot permet la séparation du mélange protéique par taille, charge et/ou
conformation par rapport au test ELISA dont le concept est différent.
 Étant donné que l'électrophorèse de protéines sur gel sépare les protéines en bandes, il est
possible de déterminer la taille de la protéine/du polypeptide cible.
 Il est également possible de (semi-) quantifier la protéine d'intérêt en exécutant en parallèle

une analyse interne de quantité sur les échantillons dans le gel.
 De la même manière, la teneur en protéines des échantillons peut être comparée (échantillon
A comporte plus de protéines que l'échantillon B).
Les applications du western blot dans les laboratoires de recherche sont nombreuses englobant:
Dot blot (principe et technique)
 Le dot blot est une technique simple de détection des molécules d’ADN, d’ARN ou de
protéines. Cette méthode permet de transféré directement les acides nucléiques (ADN ou
ARN) depuis un milieu liquide sur une membrane sans passé pas les étapes de séparation et
d’électrophorèse.
Représentation de la technique de Dot blot

Les étapes de cette technique sont les suivantes:
 Extraction et purification d’ADN ou d’ARN de différente source.
 Appliquer directement sous forme de petits points sur la membrane de nitrocellulose

(Si il s’agit de molécule d’ADN, dénaturer le par un traitement alcalin au NaOH 0,4M
pour former des brins simples).
 Les échantillons sont immobilisés sur la membrane par chauffage à 80°C pendant 2 à
3 Heures.
 Incuber la membrane portant les différents échantillons dans une solution de sondes
marquées, qui vont s’hybridées avec les molécules d’ADN ou d’ARN spécifiques.
 Illimitation des sondes non liée par lavage.
 Les sondes utilisées sont radioactive est sont détectées par autoradiographie.
 Sur la membrane les points noirs

représentent les échantillons dans
lesquels l'ADN ou l’ARN cible est
présent ou la sonde s'est liée.
Représentation de la technique de Dot blot
Image originale de Dot blot (Dubey, 2014).

Avantages et applications de la technique de Dot blot
Image originale de Dot
 Cette technique aide à détecter des molécules d’ADN ou d’ARN spécifiques blot (Dubey, 2014).
dans un échantillon sans étape d’électrophorèse.
 De nombreux échantillons peuvent être criblés en même temps en un seul

passage sur la même membrane de nitrocellulose.
 Il est possible de déterminer la quantité de l’ADN ou l’ARN spécifique en

utilisant un densitomètre qui pourrait balayer les signaux autoradiographiques
et quantifier l'intensité d'un acide nucléique hybride dans l'échantillon.
 En utilisant cette méthode, on peut comparer la quantité de séquences d'ADN

ou d'ARN présentes dans un grand nombre d'échantillons.
 Cependant, il ne fournit aucune information sur la taille des biomolécules. De

plus, si deux molécules de tailles différentes sont détectées, elles apparaîtront
sous la forme de points.
Hybridation moléculaire
 L’hybridation moléculaire ou appelée aussi hybridation des acides nucléiques
est un moyen essentiel en biologie moléculaire pour détecter une séquence
d’ADN d’intérêt.
 Elle est fréquemment utilisée soit lors de criblages de banques d’ADN

génomique ou ADNc, soit lors d’études de l’organisation de régions spécifiques
du génome par Southern blot, soit lors de l’analyse de l’accumulation des
transcrits dans les cellules. Le succès de ces méthodes dépend de la possibilité
d’obtenir des sondes d’ADN marquées à l’aide de nucléotides radioactifs ou
modifiés chimiquement.
I. Principe de l’hybridation moléculaire
 L’hybridation est une propriété fondamentale des acides nucléiques qui repose sur les règles de
complémentarité. Il est possible d’apparier des brins d’ADN (ou d’ARN) avec des oligonucléotides ou
polynucléotides qui reconnaissent spécifiquement des séquences sur les brins d’ADN de manière anti-parallèle
et complémentaire. Ces oligo- ou polynucléotides sont appelés sondes nucléiques ou amorces selon leur
utilisation.
II. Température d’hybridation
 L’hybridation complémentaire entre deux brins d’ADN homologues est appelée
renaturation. Ce phénomène est en relation directe avec la température d’hybridation
notée Th.
 La température d’hybridation Th est déterminée en utilisant plusieurs formules qui sont en

fonction de certains éléments:
 Le contenu en C+G
 Longueur du fragment (nombres de nucléotides).
 Composition du milieu
 Mis-appariement
II. Température d’hybridation
Dans le cas d’hybridation des petits oligonucléotides tel
que des amorces cette température est en déduite à
partir de la formule de Wallace qui permet de calculer la Tm = 4 (C+G) + 2(A+T); Th = Tm-5
température de fusion(Tm) représentant la température
de demi dénaturation de la chaîne de l’ADN chauffé.
Dans le cas des d’hybridation de fragment d’acide

nucléiques de taille inférieure à 100 pb , un formule
empirique tenant compte de la concentration du sel, les Tm = 16.6log [Na+] + 0.41 (%(C+G)) +
mésappariements et la concentration de formamide est 81.5-(675/Nombre de base) -
utilisée %mismatch - 0.65% de formamide
Dans le cas de longs séquences (>100) et des conditions

réactionnelles standards la Tm est calculée selon la Tm = 69.3 + 0.41 (%(C+G))
formule suivante :
III. Facteurs influençant l'hybridation
Plusieurs facteurs peuvent affectés le phénomène hybridation des acides nucléique, à savoir:
 La température d'hybridation
 La concentration de l'ADN et le temps d'hybridation
 La force ionique
 La nature des acides nucléiques
 La taille du fragment nucléique

IV. Les différents types d’hybridation
L’objectif des méthodes d’hybridation moléculaire est de détecter la présence
d’un acide nucléique spécifique par l’utilisation d’un fragment d’ADN ou d’ARN
complémentaire, appelé sonde. Cela peut être réalisé soit sur support solide, soit
en phase liquide.
IV.1. Hybridation sur support solide
 La séquence complémentaire cible est immobilisée sur un support solide. Cette méthode facilite la séparation
des fractions hybridées de celles non hybridées.
 Cependant, la vitesse d’hybridation est nettement inférieure à celle de la phase liquide (jusqu’à 10 fois). Ce
type d’hybridation est représenté par différentes techniques tel que le Southern blot, Northern blot et le dot
plot.
 Plusieurs types de supports permettent d’immobiliser les brins d’acides nucléiques:

 La nitrocellulose : représente le premier support d’immobilisation ayant été utilisé pour la fixation des
acides nucléiques. Ce support, requiert une forte concentration ionique, ce qui permet de créer des
liaisons irréversibles sous vide et à 80°C.
 Les membranes synthétiques (à base de nylon) : De même, elles nécessitent de fortes forces ioniques.
Ces membranes permettent des liaisons plus stables que celles obtenues avec la nitrocellulose à
cause de leur traitement par les rayons UV courts (254 nm). Ce type de liaison, va permettre plusieurs
déhybridations et réhybridations.
IV.1. Hybridation sur support solide
IV.2 Hybridation en phase liquide
 L’hybridation en phase liquide est plus rapide, plus sensible, est réalisée en tubes ou en
microcupules. Les segments complémentaires sont placés dans une solution contenant un
tampon et de la formamide. L’agitation thermique assure la liaison entre les fragments
complémentaires. Cette température est généralement inférieure de 15°C à la Tm de l’ADN
concerné.
 Il existe de nombreuses techniques de séparation, puis de révélation de l’hybride formé.
Selon le système choisi, la détection finale peut être réalisée selon trois méthodes:
1. les méthodes spectrophotométriques : la diminution en DO à 260nm est due à l’augmentation du taux
des hybrides.
2. la technique de la nucléase S1 : digestion des ADN et ARN simples brins.
3. La chromatographie sur hydroxylapatite : Seuls les doubles brins se fixent en raison d’une forte
concentration en sels.
IV.3. Hybridation in situ (HIS)
 C’est une technique qui permet, par l’utilisation de sondes, de mettre en évidence et de repérer, dans des
cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques connues. Elle est très proche, dans son principe, du
Southern et du Northern Blot et repose, comme eux, sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique (ADN ou
ARN) marquée avec une séquence complémentaire d'acides nucléiques que l'on cherche à identifier et à
localiser.
 A la seule différence que les Southern et Northern Blot se font sur des broyats de tissus, alors que l'HIS
s'effectue sur une coupe histologique de tissu, apportant ainsi des informations précises sur la localisation des
acides nucléiques étudiés. Les sondes utilisées sont le plus souvent de l'ADN (double brin ou plus rarement
monobrin), un ARN-messager (riboprobes) ou des oligonucléotides synthétiques (de 20 à 50 nucléotides)
 Au laboratoire, les principales applications de l’HIS sont la localisation des gènes sur des chromosomes en
métaphase et la recherche de bactéries qui ont intégré un plasmide ou un phage recombinant.
IV.4. Hybridation in situ sur chromosome (FISH)
 Cette technique permet de déterminer sur quel chromosome et dans
quelle région se trouve le gène d'intérêt et que l’on possède la sonde.
La région à étudier (située sur un chromosome préalablement
légèrement dénaturé par traitement chimique pour le débarrasser des
protéines associées) est repéré grâce à une sonde oligonucléotidique
complémentaire. Certains de ces nucléotides de cette sonde sont
couplés à une molécule antigénique reconnue par un anticorps
fluorescent. En utilisant diverses sondes, greffées à des antigènes
différents, on peut ainsi visualiser simultanément plusieurs séquences
sur un ou plusieurs chromosomes.
 Technique permettant de déterminer la position d'un fragment d'ADN dans le génome : le repérage se fait par
rapport au bras du chromosome (p: bras court et q:bras long) et

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Filière: Biotechnologie Agroalimentaire (BA)

Module : Biologie Moléculaire

PAR: Dr. Nadia LAMSAADI

Les techniques de base de la Biologie moléculaire

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